微生物菌种的保藏

一、目的和要求
　　1、了解各种保藏方法的优缺点及其适用的目标微 生物 。
　　2、学习并掌握几种常用的微 生物 菌种保藏方法。 二、原理
　　保藏微生物菌种的目的不仅要保存菌株的生命本身，而且还必须要尽可能地使菌株的遗传性状保持不变，同时保证其在整个保存过程中不被他种微生物污染。因此，选择一种能够长期有效且稳定的保藏微生物菌种的方法事关重要。
　　由于微生物种类繁多，且保存方法的难易程度不同，所以微生物菌种的保藏方法亦有许多。但是不管有多少种菌种保藏方法，其基本原理都要求使微生物的代谢作用降至最低程度，从而使其处于不活泼的状态，即休眠状态。就微生物本身而言，保藏就是要利用它们处于休眠状态的孢子或芽孢而进行；而从环境条件来说，就是要选用低温、干燥和缺氧等三个条件。以下将对几种微生物菌种的保藏方法加以简单介绍。
　　1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
　　传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
　　一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
　　传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。

　　2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。

　　3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如：
　　① 土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
　　使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的 试管 中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种，培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止，移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封，冷藏或室温保存。
　　② 砂土保存法：取清洁的砂，过60目筛去掉大砂粒，并用磁铁吸去砂中铁屑，再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗数次，干燥后，置于 试管 或安瓶管中保持2～3cm深，再经干热灭菌后，加入1ml菌种培养液，经充分混匀后，放入真空干燥器中，完全干燥后熔封保存。也可用二份洗净的砂（经HCl预处理）和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌，再进行菌种保藏。
　　③ 硅胶保存法：以6～16目的无色硅胶代替砂子，干热灭菌后，加入菌液。加菌液时，由于硅胶的吸附热常使温度升高，因而需设法加以冷却。
　　④ 磁珠保存法：将菌液浸入素烧磁珠（或多孔玻璃珠）后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶（或无水CaSO ₄ ），上铺玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，经干热灭菌后，接入菌悬液，最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效，特别适用于根瘤菌，可保存长达两年半时间。
　　⑤ 麸皮保存法：在麸皮内加入60%的水，经灭菌后接种培养，最后干燥保藏。
　　⑥ 纸片（滤纸）保存法：将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中，常压或减压干燥后，置于装有干燥剂的容器内进行保存。