细胞荧光化学实验
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一、实验目的
1、进—步熟悉荧光显微镜的使用方法。
2、初步了解几种常用的荧光染色方法。
二、实验用品
荧光显微镜、水浴锅、载玻片、盖玻片、镊子、消毒牙签
三、实验原理
荧光法较一般光学方法具有灵敏度高、特异性强、方法简便等优点，因此近年来荧光组织化学特别是免疫荧光技术有了很大的发展。利用荧光技术可研究细胞内化学成分的分布与定位，研究细胞与组织中物质的吸收与转运，进行病理鉴别以及细胞免疫等方面的研究。
当用一种波长的光(如紫外光)照射某种物质时，这种物质会在极短的时问内发射出较照射波长为长的光(可见的光)，这种光就称为荧光。有些 生物 材料受到紫外线照射后能直接发出荧光称自发荧光(或直接荧光)；有的 生物 材料受紫外线照射后并不发光，但当它吸收荧光染料后，也同样产生荧光，称间接荧光(或次生荧光)。与生物学有关的荧光现象有五种：
1、 自发荧光 如叶绿索、维生素A的红色荧光、胶原纤维的蓝绿色荧光、脂褐素的蓝色荧光等。
2、 诱发荧光 通过诱导剂作用而发的荧光，如甲醛蒸气处理可诱发细胞和组织中生物单胺类(儿茶酚胺、5—羟色胺等)产生荧光。
3、荧光染料染色荧光 即经染色后荧光染料与细胞中某些成分结合而产生的荧光。
4、酶诱发荧光 通过细胞内酶的作用，使某些不发荧光的物质转换为发荧光的产物。如细胞内的脂酶可使不发荧光的二醋酸荧光素分解为发荧光的荧光素。
5、免疫荧光 荧光染料和抗体以共价键结合，这种标记的抗体再和相应的抗原形成抗原—抗体复合物，经激发后发射荧光，用以辨认抗原。
细胞和组织所产生的荧光必须通过 荧光显微镜 进行观察或通过显微荧光光度计进行定量测定。除少数生活物质含有自发荧光外，大多数研究需外加荧光染料，进行特异性结合而得以显示。.
四．实验方法
(一)几种荧光染料对细胞染色的观察
细胞吖啶橙荧光染色的观察 ：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。
1．将生长有培养细胞的玻片或鸡血涂片放入95%乙醇中固定15—30分钟，干燥；
2．在1%醋酸中酸化30秒；
3．在标本片上滴加足量的0．01%吖啶橙磷酸缓冲染液，染色5-10分钟；
4．用pH4．8磷酸缓冲液洗1分钟；
5．0.1mol／L氯化钙分化30秒或几分钟；
6．PBS漂洗三次，每次数秒钟；
7．在干净载玻片上滴—滴PBS，将标本片有细胞面向下临时封固，或在血涂片上滴加磷酸缓冲液后加盖玻片临时封固；
8．在 荧光显微镜 下观察，用蓝紫光激发滤片，可见细胞核为绿色，细胞质为橙红色，但常因细胞质的pH值的变化而呈棕色至鲜红色。
(二)活细胞双荧光染色观察细胞核和线粒体
一般的生物染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透性，染料才能进入细胞内。但有些活体染料能进入活细胞，并对细胞不产生毒性作用。 荧光染料 Ho33342和若丹明123都是活体染料。Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，若丹明123能与线粒体进行特异的结合。采用两种 荧光染料 的混合染液可对一个活细胞的核和线粒体同时染色。
1. 用牙签在自己口腔颊粘膜处刮取上皮细胞涂于干净载玻片上；
2.滴一滴双荧光染液(含0．25ug／mL Ho33342和若丹明123 1ug／mL的PBS液)于细胞上；
3.加上盖玻片(注意防止气泡)，用指甲油把盖玻片边缘封好；
4.用落射式荧光显微经观察。先用高倍镜观察细胞核(采用紫外光激发滤片／双色束分离器／内装阻断滤片的组合插块置于光路)，可见核发蓝荧光。再换油镜观察线粒体(换用紫光或蓝光的组合插块)，在细胞核附近的胞质中可见有一些发绿光的圆形和短秆状颗粒分布，即为线粒体。
五、荧光组化实验中应注意的几个问题
1．每种荧光染料，均有自己的最适PH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的PH值的 缓冲液 中进行。
2．一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。
3．在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。
4．一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。
1、进—步熟悉荧光显微镜的使用方法。
2、初步了解几种常用的荧光染色方法。
二、实验用品
荧光显微镜、水浴锅、载玻片、盖玻片、镊子、消毒牙签
三、实验原理
荧光法较一般光学方法具有灵敏度高、特异性强、方法简便等优点，因此近年来荧光组织化学特别是免疫荧光技术有了很大的发展。利用荧光技术可研究细胞内化学成分的分布与定位，研究细胞与组织中物质的吸收与转运，进行病理鉴别以及细胞免疫等方面的研究。
当用一种波长的光(如紫外光)照射某种物质时，这种物质会在极短的时问内发射出较照射波长为长的光(可见的光)，这种光就称为荧光。有些 生物 材料受到紫外线照射后能直接发出荧光称自发荧光(或直接荧光)；有的 生物 材料受紫外线照射后并不发光，但当它吸收荧光染料后，也同样产生荧光，称间接荧光(或次生荧光)。与生物学有关的荧光现象有五种：
1、 自发荧光 如叶绿索、维生素A的红色荧光、胶原纤维的蓝绿色荧光、脂褐素的蓝色荧光等。
2、 诱发荧光 通过诱导剂作用而发的荧光，如甲醛蒸气处理可诱发细胞和组织中生物单胺类(儿茶酚胺、5—羟色胺等)产生荧光。
3、荧光染料染色荧光 即经染色后荧光染料与细胞中某些成分结合而产生的荧光。
4、酶诱发荧光 通过细胞内酶的作用，使某些不发荧光的物质转换为发荧光的产物。如细胞内的脂酶可使不发荧光的二醋酸荧光素分解为发荧光的荧光素。
5、免疫荧光 荧光染料和抗体以共价键结合，这种标记的抗体再和相应的抗原形成抗原—抗体复合物，经激发后发射荧光，用以辨认抗原。
细胞和组织所产生的荧光必须通过 荧光显微镜 进行观察或通过显微荧光光度计进行定量测定。除少数生活物质含有自发荧光外，大多数研究需外加荧光染料，进行特异性结合而得以显示。.
四．实验方法
(一)几种荧光染料对细胞染色的观察
细胞吖啶橙荧光染色的观察 ：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。
1．将生长有培养细胞的玻片或鸡血涂片放入95%乙醇中固定15—30分钟，干燥；
2．在1%醋酸中酸化30秒；
3．在标本片上滴加足量的0．01%吖啶橙磷酸缓冲染液，染色5-10分钟；
4．用pH4．8磷酸缓冲液洗1分钟；
5．0.1mol／L氯化钙分化30秒或几分钟；
6．PBS漂洗三次，每次数秒钟；
7．在干净载玻片上滴—滴PBS，将标本片有细胞面向下临时封固，或在血涂片上滴加磷酸缓冲液后加盖玻片临时封固；
8．在 荧光显微镜 下观察，用蓝紫光激发滤片，可见细胞核为绿色，细胞质为橙红色，但常因细胞质的pH值的变化而呈棕色至鲜红色。
(二)活细胞双荧光染色观察细胞核和线粒体
一般的生物染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透性，染料才能进入细胞内。但有些活体染料能进入活细胞，并对细胞不产生毒性作用。 荧光染料 Ho33342和若丹明123都是活体染料。Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，若丹明123能与线粒体进行特异的结合。采用两种 荧光染料 的混合染液可对一个活细胞的核和线粒体同时染色。
1. 用牙签在自己口腔颊粘膜处刮取上皮细胞涂于干净载玻片上；
2.滴一滴双荧光染液(含0．25ug／mL Ho33342和若丹明123 1ug／mL的PBS液)于细胞上；
3.加上盖玻片(注意防止气泡)，用指甲油把盖玻片边缘封好；
4.用落射式荧光显微经观察。先用高倍镜观察细胞核(采用紫外光激发滤片／双色束分离器／内装阻断滤片的组合插块置于光路)，可见核发蓝荧光。再换油镜观察线粒体(换用紫光或蓝光的组合插块)，在细胞核附近的胞质中可见有一些发绿光的圆形和短秆状颗粒分布，即为线粒体。
五、荧光组化实验中应注意的几个问题
1．每种荧光染料，均有自己的最适PH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的PH值的 缓冲液 中进行。
2．一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。
3．在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。
4．一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。
