层粘连蛋白（Laminin，LN）的分离
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层粘连蛋白（Laminin，LN）是一种主要存在于上皮细胞外基质中的大分子非胶原性糖蛋白（分子量约为20~40万）。其功能与FN相似，影响着胚胎细胞的发育和胚胎团块的形成。现已发现LN与神经细胞的运动、分化及肿瘤的转移关系密切。许多研究都表明LN是机体中一种重要的糖蛋白组分。因此，分离提纯LN将为我们深入地研究细胞外环境与细胞运动、增殖、分化之间的关系，研究肿瘤转移的机制提供方便。
基于LN主要存在于基膜中，我们选择含有大量的EHS小鼠肉瘤为材料，用一定浓度0.5mol/L NaCl及脱氧胆酸钠进行抽提基膜中的LN等，用高盐（1.7mol/L NaCl）除去其中的杂质胶原。最后通过Sephacryl S-300分子筛层析柱，便可制得纯化的LN。
操作方法：
1．取裸鼠体内传代的EHS瘤10g，剪碎并匀浆。
2．用（Tris-HCl pH7.6，1%脱氧胆酸钠，0.5%PMSF，0.5%细球菌 核酸酶 ）溶液，4℃搅拌抽提20min。
3．1,000g×10min，4℃，离心，弃上清。
4．沉淀用 Tris -HCl pH7.6，1%脱氧胆酸钠、0.5%PMSF溶液洗涤2次，1,000g×10min，4℃，离心，弃上清。
5．沉淀用 Tris -HCl pH7.6，0.5%PMSF溶液洗涤2次，1,000g×10min，4℃，离心，弃上清。
6．沉淀再用 Tris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、0.5mol/L NaCl溶液，4℃搅拌抽提过夜。
7．1,000g×20min，4℃，离心，弃沉淀。
8．上清中慢慢加入固体NaCl，至终浓度1.7mol/L，其间不断搅动溶液。冰浴置4h。
9．10,000g×20min，4℃，离心，弃沉淀（胶原）。
10．上清用超薄滤膜浓缩或将其袋入 透析袋 ，在袋外放一些PEG6000来进行浓缩至体积为5ml。
11．上样品到已经用Tris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、0.5mol/L NaCl溶液平衡了的Sephacryl S-300 层析柱上（平衡柱需4倍柱体积的平衡液），并用同一溶液洗脱。收集留出的第一峰，即电泳纯LN。
12．产率计算 应用考马斯亮蓝G-250 测蛋白浓度法，以BSA为标准，测定595nm处的光吸收，计算LN的含量。一般产率为0.5~1ug LN/g瘤。
13．存储 浓缩LN （1mg/ml），分装后－70℃保存。
基于LN主要存在于基膜中，我们选择含有大量的EHS小鼠肉瘤为材料，用一定浓度0.5mol/L NaCl及脱氧胆酸钠进行抽提基膜中的LN等，用高盐（1.7mol/L NaCl）除去其中的杂质胶原。最后通过Sephacryl S-300分子筛层析柱，便可制得纯化的LN。
操作方法：
1．取裸鼠体内传代的EHS瘤10g，剪碎并匀浆。
2．用（Tris-HCl pH7.6，1%脱氧胆酸钠，0.5%PMSF，0.5%细球菌 核酸酶 ）溶液，4℃搅拌抽提20min。
3．1,000g×10min，4℃，离心，弃上清。
4．沉淀用 Tris -HCl pH7.6，1%脱氧胆酸钠、0.5%PMSF溶液洗涤2次，1,000g×10min，4℃，离心，弃上清。
5．沉淀用 Tris -HCl pH7.6，0.5%PMSF溶液洗涤2次，1,000g×10min，4℃，离心，弃上清。
6．沉淀再用 Tris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、0.5mol/L NaCl溶液，4℃搅拌抽提过夜。
7．1,000g×20min，4℃，离心，弃沉淀。
8．上清中慢慢加入固体NaCl，至终浓度1.7mol/L，其间不断搅动溶液。冰浴置4h。
9．10,000g×20min，4℃，离心，弃沉淀（胶原）。
10．上清用超薄滤膜浓缩或将其袋入 透析袋 ，在袋外放一些PEG6000来进行浓缩至体积为5ml。
11．上样品到已经用Tris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、0.5mol/L NaCl溶液平衡了的Sephacryl S-300 层析柱上（平衡柱需4倍柱体积的平衡液），并用同一溶液洗脱。收集留出的第一峰，即电泳纯LN。
12．产率计算 应用考马斯亮蓝G-250 测蛋白浓度法，以BSA为标准，测定595nm处的光吸收，计算LN的含量。一般产率为0.5~1ug LN/g瘤。
13．存储 浓缩LN （1mg/ml），分装后－70℃保存。
