微粒体酶的制备

在化学致癌致突变的实验研究中，除少数化学物质，如烷化剂、亚硝基酰胺、碱基类似物石棉等不需活化外，大部分化学物质均需经代谢活化或其代谢活化产物才能引起靶细胞的致癌致突变作用。通常用的活化系统为大鼠肝微粒体酶（简称S-9），这是一种复合酶系，广泛地分布在各种哺乳动物细胞的微粒体和核膜上，其主要成分有三种类型，即NADPH-细胞色素P-450还原酶、磷酸胆碱和血红素蛋白以及细胞色素P-450。它们的作用包括芳香族和脂族八九的羟化作用，芳烃和链烯的氧化类型，氧化N,D-和S-脱烷化、亚磺酸化、去氨基化以及脱卤化作用等。对各种动物，如大鼠、小鼠、兔、地鼠、和豚鼠的比较研究中，大鼠肝活性最高、兔肺活性最高；尤其是大鼠经不同诱物，如烟凝结物、多氯联苯、苯并（a）芘、20-甲基胆蒽和二甲基亚砜等化合物活性比较研究中，以多氯联苯诱导的S-9活性最高；诱导物多次注射比一次诱导的S-9为高，雄性动物又高于雌性动物。因此，用比较敏感的姐妹染色单体交换频率的方法检测各种化学物质致癌和致突变，Ames实验均需用如鼠微粒体酶对化学物质的活化性能与靶细胞起作用。目前，鼠肝微粒体酶在检测致癌、致突变实验研究中的应用日益受到关注。
操作方法：
所有操作需在0～4℃下进行。
1．大鼠按500mg/kg体重的多氯联苯剂量，给予腹腔注射200mg多氯联苯/ml和玉米油0.5ml，隔日一次，共2次，第5日起断食（只给水）24h。
2．动物断头后置石腊板上在超净工作台上，皮肤经碘酒和酒精消毒，迅速打开胸腹腔，用无菌剪和镊子取出肝脏，置于盛有0.15mol/L KCl溶液的烧杯内（烧杯置于4℃水浴内）洗涤2～3次，去血液，称重。
3．用镊子撕碎肝脏，去除结缔组织和血管，转入已灭菌的小烧杯内。
4．用无菌剪剪碎组织，加入3倍体积0.15mol/L KCl溶液，置匀浆器匀浆5～10min
5．经匀浆的肝组织悬液，置 离心管 ，11,000g×10～15min离心，上清即为鼠肝S­-9。
6．在无菌室的冰浴中，将提取物以1ml分装在 冻存管 内，液氮保存。
7．临用时，1ml冻存提取液加9ml 缓冲液 （8mmol/L MgCL ₂ 、5mmol/L G6p，5mmol/L NADPH，0.1mol/L Na ₂ HPO ₄ ­-NaH ₂ PO ₄ ，pH7.4）相混合