蛋白质的沉淀反应、颜色反应、两性反应、电荷及等电点的测定

一、实验目的
1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。
2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。
3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。

二、实验原理
(一)蛋白质的沉淀反应原理
蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH ₃ ⁺ ，—COO-，—SH，—CONH ₂ 等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。 蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：
1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。
2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。
4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。
用盐析法或低温下加入丙酮、乙醇使蛋白质沉淀，以及利用等电点的沉淀反应时，虽然蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变，仍保持原有的生物活性。如除去沉淀因素，蛋白质可重新溶解在原来的溶剂中。因此，这种沉淀作用称为可逆沉淀作用。但如在温度较高情况下加入有机溶剂来沉淀分离蛋白质或已用有机溶剂沉淀分离得到的蛋白质没有及时与有机溶剂分开，都会引起蛋白质的性质发生改变，这应该注意。
(二)蛋白质的颜色反应原理
蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。重要的颜色反应有：
1.双缩脲反应
将尿素加热到180℃，则两分子尿素缩合而成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜色在540nm 处比色，定量测定蛋白质。
2.蛋白质的黄色反应
是含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱颜色加深呈橙黄色，这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。例如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。
3.米伦氏反应
米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。
4.茚三酮反应
蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切氨基酸及α-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。
5.乙醛酸反应
在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有这一反应。色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有此反应，不含色氨酸的白明胶就无此反应。
6.坂口反应
精氨酸分子中含有胍基，能与次氯酸钠(或次溴酸钠)及α-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物。此反应可以用来鉴定含有精氨酸的蛋白质，也可用来定量测定精氨酸含量。