基因组合生物合成新化合物

实验目的
组合生物合成是将不同化合物的生物合成基因重新组合后，形成新的生物合成途径，从而产生新的化合物，这是新药研究中的重要进展。

目前许多具有生理活性的天然产物的生物合成途径已经研究清楚，利用组合生物合成技术通过改变聚酮合成酶的基因合成了一系列“非天然的”的聚酮类化合物库，以供进一步的活性筛选。本实验利用微生物中的聚酮体生物合成基因重组，产生新的化合物。

实验原理
加利利链霉菌ATCC31671产生2-羟基阿克拉菌酮（2-hydroxyaklavinone）。将含有聚酮体酮基还原酶（polyketide ketoreductase，PKR）的质粒pWX03转入加利利链霉菌ATCC31671，可以产生阿克拉菌酮（aklavinone）。

第一部分 链霉菌质粒DNA提取

实验材料和试剂
菌种：质粒pWX03（含PKR）/变铅青链霉菌（S. lividans TK18）。
溶液：1．溶菌酶溶液：0.3mol/L 蔗糖
25mmol/L Tris-HCl（pH8.0）
25mmol/L EDTA（pH8.0）
2mg/ml 溶菌酶
2．碱性裂解液：0.3mol/L NaOH
2% SDS
3．7.5mol/L NH4Ac溶液
4．TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）
1mmol/L EDTA（pH8.0

实验步骤
1．从含质粒pWX03的变铅青链霉菌（S. lividans TK18）斜面上挖块接种到20ml R2YE培养基（补加硫链丝菌素至作用浓度为25mg/ml）中。28℃ 200r/min 培养48小时。
2．取菌液1ml于eppendorf管中，3000r/min离心5分钟，收集菌体。
3．将菌体悬浮于500ml溶菌酶溶液中，37℃水浴中保温。每隔5分钟取一滴溶菌悬浮液于载玻片上，加入一滴碱性裂解液时，会变成透明粘稠为止。（如果发现不粘稠，则是DNA已经降解，最好用新鲜的菌丝重做。）
4．加入250ml碱性裂解液，迅速颠倒混匀，置65℃水浴中保温10～15分钟，取出在冰上放置3分钟。
5．加入380ml 7.5mol/L NH4Ac溶液，混匀，冰上放置10分钟。10,000 r/min离心10分钟。
6．将上清液转移到二个新eppendorf管中，每管约500 ml。
7．加入1000 ml无水乙醇，混匀，-20℃放置60分钟，沉淀DNA。
8．10,000rpm离心10分钟，弃上清。干燥，沉淀溶于20 ml TE缓冲液中。合并二管DNA样品到一个管中。
取10 ml DNA样品，琼脂糖凝胶电泳检查