转氨作用
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【
实验目的
】
1．通过实验掌握水平方向滤纸层析原理和技术
2．了解转氨作用过程。
【 实验原理 】
转氨基作用是由转氨酶（氨基转移酶）催化的，在这个反应中，α-氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基之间交换，α-氨基酸转变成相应的α-酮酸，α-酮酸变成新的一种α-氨基酸。转氨基作用是一种可逆反应。每个转氨基反应均由专一的转氨酶所催化，在不同的生物有机体中均有转氨酶分布。
本实验是将丙氨酸和α-酮戊二酸与肝匀浆一起水浴反应，肝中的丙氨酸氨基转移酶（ALT，又称谷丙转氨酶GPT）含量丰富，该酶可将丙氨酸的氨基转移给α-酮戊二酸，产生丙酮酸和谷氨酸。利用圆盘纸层析鉴定谷氨酸的存在，并且验证组织中的转氨作用。在肝脏谷丙转氨酶(GPT)催化的转氨基作用，反应方程式如下：
【 实验材料 】
1． 实验器材
培养皿；表面皿；滤纸；匀浆器；试管；试管架；恒温水浴锅；毛细管；移液管；喷雾器；剪刀；铅笔；格尺。
2． 实验 试剂
⑴ 0.01M pH7.4磷酸缓冲液：0.2MNa 2 HPO 4 溶液81ml, 0.2MNaH 2 P0 4 溶液19ml混匀，蒸馏水稀释20倍。
⑵ 0.1M丙氨酸溶液：称取丙氨酸0.891克先溶于少量0.01MpH7.4磷酸缓冲液中，以1MNa0H仔细调节至pH7.4后，用磷酸盐缓冲液加至100ml。
⑶ 0.01Mａ-酮戊二酸溶液：称取ａ-酮戊二酸1.461克先溶于少量0.01M pH7.4磷酸缓冲液中，用1M Na0H仔细调节至pH7.4后，用磷酸盐缓冲液加至100ml。
⑷ 0.1M谷氨酸溶液：称取谷氨酸0.735克先溶于少量0．01M pH7.4磷酸缓冲液中， 以1MNa0H仔细调节至pH7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。
⑸ 0.2％茚三酮溶液：称取茚三酮0.2克溶于100ml 95％乙醇中。
(6)层析溶剂：水饱和的苯酚。
【 实验操作 】
1． 肝匀浆的制备：
取新鲜的猪肝5g,加入20m1预冷0.01M pH7.4磷酸缓冲液，用捣碎机迅速成匀浆(1万转大约30秒)。两人一组进行如下的实验。
2． 转氨反应：
取干燥大试管二支，分别标明测定管与对照管，按下表进行操作：
取出冷却后，分别用滤纸过滤或2000rpm离心3～5分钟，滤液或上清液分别收集到新的干燥小
试管
中。
3. 纸层析：
⑴ 取直径12cm圆形滤纸一张，通过圆心作两条2cm相互垂直的线，两个线的末端作点样点，分别标定“测定”、“对照”、“谷氨酸”、“丙氨酸”。
⑵ 取4支毛细管，分别吸取测定管溶液、0.1M谷氨酸溶液、对照管溶液、0.1M丙氨酸溶液。在点样处点样，注意斑点不可太大，直径要小于0.3cm。而且每点一滴，吹干后方可再点第二滴，每个样品可点2～3次。
⑶ 在滤纸圆心处打一小孔(1mm直径)，另取同类滤纸条(0.5×2.5cm)，下一半剪成须状，卷成圆筒，如灯芯，从点样相反的一侧插入小孔。
⑷ 将层析溶剂(水饱和酚溶液)放入直径为3～5cm的干燥表面皿正中，表面皿置于直径10cm培养皿正中，将滤纸放平在培养皿上，灯芯浸入溶剂中，将另一同样大小培养皿反盖上，溶剂沿灯芯上升到滤纸，再向四周扩展，（层析时间大约45～60分钟）。溶剂前缘距滤纸边缘约1cm时即可取出，用铅笔划出溶剂的边缘， 烘箱 中干燥之。
⑸ 显色：将滤纸放在培养皿上，喷0.2%的茚三酮乙醇溶液， 烘箱 中干燥，滤纸上会呈现紫色弧状条带。
【 实验结果 】
用铅笔画出条带的边框，测出表格中的数值，计算R f 值。
与已知的标准的
氨基酸
Rf进行对比，指出条带所对应的
氨基酸
，并根据结果解释转氨作用。
【 注意事项 】
1．层析 滤纸 不可用手触摸，以免有手印。
2．在 滤纸 上划线时只需用铅笔，不可用其它笔。
3．烘烤时要注意明火。
4．点样时毛细管不能交叉污染。
【 思考 】
1．如果对照管在沸水中煮的时间不够充分，会在层析结果中出现什么现象？
2．氨基酸纸上色谱鉴定法操作的关键是什么？
1．通过实验掌握水平方向滤纸层析原理和技术
2．了解转氨作用过程。
【 实验原理 】
转氨基作用是由转氨酶（氨基转移酶）催化的，在这个反应中，α-氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基之间交换，α-氨基酸转变成相应的α-酮酸，α-酮酸变成新的一种α-氨基酸。转氨基作用是一种可逆反应。每个转氨基反应均由专一的转氨酶所催化，在不同的生物有机体中均有转氨酶分布。
本实验是将丙氨酸和α-酮戊二酸与肝匀浆一起水浴反应，肝中的丙氨酸氨基转移酶（ALT，又称谷丙转氨酶GPT）含量丰富，该酶可将丙氨酸的氨基转移给α-酮戊二酸，产生丙酮酸和谷氨酸。利用圆盘纸层析鉴定谷氨酸的存在，并且验证组织中的转氨作用。在肝脏谷丙转氨酶(GPT)催化的转氨基作用，反应方程式如下：
【 实验材料 】
1． 实验器材
培养皿；表面皿；滤纸；匀浆器；试管；试管架；恒温水浴锅；毛细管；移液管；喷雾器；剪刀；铅笔；格尺。
2． 实验 试剂
⑴ 0.01M pH7.4磷酸缓冲液：0.2MNa 2 HPO 4 溶液81ml, 0.2MNaH 2 P0 4 溶液19ml混匀，蒸馏水稀释20倍。
⑵ 0.1M丙氨酸溶液：称取丙氨酸0.891克先溶于少量0.01MpH7.4磷酸缓冲液中，以1MNa0H仔细调节至pH7.4后，用磷酸盐缓冲液加至100ml。
⑶ 0.01Mａ-酮戊二酸溶液：称取ａ-酮戊二酸1.461克先溶于少量0.01M pH7.4磷酸缓冲液中，用1M Na0H仔细调节至pH7.4后，用磷酸盐缓冲液加至100ml。
⑷ 0.1M谷氨酸溶液：称取谷氨酸0.735克先溶于少量0．01M pH7.4磷酸缓冲液中， 以1MNa0H仔细调节至pH7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。
⑸ 0.2％茚三酮溶液：称取茚三酮0.2克溶于100ml 95％乙醇中。
(6)层析溶剂：水饱和的苯酚。
【 实验操作 】
1． 肝匀浆的制备：
取新鲜的猪肝5g,加入20m1预冷0.01M pH7.4磷酸缓冲液，用捣碎机迅速成匀浆(1万转大约30秒)。两人一组进行如下的实验。
2． 转氨反应：
取干燥大试管二支，分别标明测定管与对照管，按下表进行操作：
|
试剂 (ml) |
测定管 |
对照管 |
|
肝匀浆 |
0.5 |
0.5 |
|
|
|
放入沸水中煮5分钟， 冷却，摇匀 |
|
0.1M 丙氨酸溶液 |
0.5 |
0.5 |
|
0.01M α-酮戊二酸溶液 |
0.5 |
0.5 |
|
0.01 M pH7.4 磷酸缓冲液 |
1.5 |
1.5 |
|
摇匀，放进37℃水浴保温50分钟 |
||
|
沸水浴中煮5分钟，终止反应，取出冷却后摇匀 |
3. 纸层析：
⑴ 取直径12cm圆形滤纸一张，通过圆心作两条2cm相互垂直的线，两个线的末端作点样点，分别标定“测定”、“对照”、“谷氨酸”、“丙氨酸”。
⑵ 取4支毛细管，分别吸取测定管溶液、0.1M谷氨酸溶液、对照管溶液、0.1M丙氨酸溶液。在点样处点样，注意斑点不可太大，直径要小于0.3cm。而且每点一滴，吹干后方可再点第二滴，每个样品可点2～3次。
⑶ 在滤纸圆心处打一小孔(1mm直径)，另取同类滤纸条(0.5×2.5cm)，下一半剪成须状，卷成圆筒，如灯芯，从点样相反的一侧插入小孔。
⑷ 将层析溶剂(水饱和酚溶液)放入直径为3～5cm的干燥表面皿正中，表面皿置于直径10cm培养皿正中，将滤纸放平在培养皿上，灯芯浸入溶剂中，将另一同样大小培养皿反盖上，溶剂沿灯芯上升到滤纸，再向四周扩展，（层析时间大约45～60分钟）。溶剂前缘距滤纸边缘约1cm时即可取出，用铅笔划出溶剂的边缘， 烘箱 中干燥之。
⑸ 显色：将滤纸放在培养皿上，喷0.2%的茚三酮乙醇溶液， 烘箱 中干燥，滤纸上会呈现紫色弧状条带。
【 实验结果 】
用铅笔画出条带的边框，测出表格中的数值，计算R f 值。
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测定参数 |
测定样品 |
谷氨酸 |
丙氨酸 |
对照 |
|
点样点到斑纹中心距离 (cm) |
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|
点样点到溶剂前沿距离 (cm) |
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R f 值 |
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【 注意事项 】
1．层析 滤纸 不可用手触摸，以免有手印。
2．在 滤纸 上划线时只需用铅笔，不可用其它笔。
3．烘烤时要注意明火。
4．点样时毛细管不能交叉污染。
【 思考 】
1．如果对照管在沸水中煮的时间不够充分，会在层析结果中出现什么现象？
2．氨基酸纸上色谱鉴定法操作的关键是什么？
