圆形滤纸色谱法分离氨基酸

一、原理
用各种标准氨基酸的混合物和几种未知氨基酸在相同条件下的同一张圆形滤纸上进行层析。层析后滤纸上的氨基酸用茚三酮显色剂显色得到纸色谱和各种标准及未知 氨基酸的Rf值，将未知氨基酸的Rf值与各种标准氨基酸的Rf值相对照，以达到离、鉴定氨基酸的目的。必须注意手指印含有一定量的氨基酸，故不能用手直接 接触分析用的滤纸和滤纸条， 要用镊子钳夹滤纸边。
二、 仪器 和 试剂
1.圆形滤纸(直径15厘米)、滤纸条(2x1 厘米)
2.毛细玻管
3.培养皿( 直径 l1-12 厘米 )
4.电吹风机
5.喷雾器
6.镊子、剪刀、圆规、直尺、铅笔
7.标准氨基酸溶液：0.1%丙氨酸水溶液，0.1% 精氨酸水溶液，0.1% 亮氨酸水溶液(加微量NaOH 使之溶解)
8.层析溶剂： 正丁醇:醋酸:乙醇:水 =4:1:1:2(V/V) 混合后的上清液。
9.0.1%茚三酮溶液：0.1克茚三酮溶于100毫升95%乙醇中。
10.待测氨基酸样品：丙氨酸、精氨酸、亮氨酸混合溶解(每种氨基酸的浓度均为0.1%) 。
三、操作：
1．滤纸的处理
取圆形滤纸一张以滤纸中心为圆心，用圆规画半径为1厘米的圆，在圆心处用打孔器打一个小孔。用铅笔过圆心将滤纸分成4等份，并在滤纸边缘上分别标上丙、精、亮、混字样。
2．点样
在圆规画的圆周上每一等份的中点(即原点) 用干净毛细玻管小心点上0.1%丙氨酸、 0.1%精氨酸、0.1%亮氨酸和混合氨基酸样品，点样直径约为2毫米，不宜过大，并把滤纸放在空气中晾干。
3．层析
将滤纸条卷成圆筒(如灯芯)，插入滤纸小孔，注意吻合紧密，勿使滤纸芯突出纸面，下端刚好接触培养皿底为宜。用吸量管吸取层析溶剂5-10 毫升加入干燥、洁净的培养皿中，勿使溶剂沾到培养皿的边沿上，将点好样品的滤纸平放在培养皿上，纸芯浸入层析溶剂中， 并迅速用同样大小的培养皿严密覆盖在上面。此时可见溶剂沿纸芯上升到圆形滤纸上，然后向滤纸四周徐徐扩散。待溶剂前沿到培养皿边缘约0.5厘米处时，即可取出滤纸，拔出纸芯， 用铅笔标出溶剂前沿的位置，用电吹风机吹干。
4．显色
用喷雾器喷上0.1%茚三酮于滤纸上，应喷洒均匀，或用洗相的方式将滤纸在0.1%茚三酮溶液中浸泡一下，再用电吹风吹干或放入 烘箱 中于105℃烘干。此时可显出各 氨基酸 的紫红色弧形带，用铅笔标点各弧形色带中心。
5．定性鉴定
量出每个弧形色带中心到原点的距离和溶剂前沿到原点的距离，求出各标准 氨基酸 和混合氨基酸溶液中各氨基酸的Rf值，比较各孤形色带Rf值及色泽，确定出混合氨基酸溶液中的各种氨基酸，解释各种氨基酸为什么有移动速度的差别。