动物血中超氧化物歧化酶的提取

[原理]
l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。 自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。
从动物血液材料中制备Cu Zn-SOD纯化工艺分为三个主要步骤：
（1）原材料的预处理；
（2）粗酶液的制备；
（3）离子交换柱层析精制。
国内多采用Mccord和Fridovich法，其主要工艺过程为：
第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白；
第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；
第三步，离子交换柱层析精制。

[ 试剂 和器材]
1、 试剂
（1）3.8%（质量分数）柠檬酸三钠
（2）0.9%（质量分数）氯化钠
（3）95%（体积分数）乙醇
（4）氯仿
（5）丙酮
（6）pH7.6、2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液
（7）DEAE-Sephadex A-50

2、 器材
（1）猪血
（2）恒温水浴
（3） 离心机
（4）布氏漏斗、抽滤瓶
（5）烧杯、量筒、搅棒
（6）透析袋

[方法和步骤]
1、从猪血中提取SOD
（1）分离血球
取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球。
（2）除血红蛋白
红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。
（3）热变性
上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3 000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。
（4）沉淀
清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置2～3min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。沉淀物用少量 蒸馏 水溶解，4 000r/min离心20min，除去不溶物，用pH7.6的2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4 缓冲液 透析，即得粗SOD溶液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。