醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质

一、目的：

学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。

二、原理：

带电质点在电场中移动的现象称为电泳。电泳现象早在19世纪初期就被人们发现了，并用于胶体化学中，但是电泳技术的广泛应用则在20世纪40年代左右。近年来各种类型的电泳技术发展十分迅速。例如，纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。在电泳形式上更是丰富多样，有在溶液中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，也有做成平板的或柱状的。由于与光学系统和自动分部收集器相结合，又组成了等电聚焦仪，等速电泳仪等等，大大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。

各种类型的电泳技术概括如表7-1：任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。例如，氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。

不同的质点在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度的定义是带电质点在单位电场强度下的泳动速度。即：

泳动度首先取决于带电质点的性质，即质点所带净电荷的量、质点的大小和质点的形状。一般来说，质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。泳动度除受质点本身性质的影响外，还受其他外界因素的影响，如溶液的粘度等。影响泳动速度的主要外界因素还有下列几种：

（一）电场强度（电势梯度）

电场强度是指每cm的电压降，它对泳动速度起着十分重要的作用。例如，纸上电泳的支持物滤纸两端相距20cm，如电压降为200V，则电场强度为200V/20cm=10V·cm^-1。电场强度越高，带电质点移动速度越快。根据电场强度的大小，可将电泳分为常压（100~500V）电泳和高压（500~10 000V）电泳。常压电泳的电场强度一般为2~10V·cm^-1，电泳分离时间较长，需要几小时至几天；高压电泳的电场强度为20~200V·cm^-1，电泳分离时间较短，有时仅需几分钟。常压电泳多用于分离蛋白质等大分子物质，而高压电泳则用来分离氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质。在生产中有时需要进行快速的中间分析，如果没有高压电泳设备，可以把常压电泳小型化，缩短滤纸两端距离，也可达到高压快速的目的。如将原来两端相距20cm的滤纸改为5cm，外加电压仍为200V，电场强度则变为40V·cm^-1，这样就加快了电泳速度。

（二）溶液的pH值

溶液的pH值决定带电质点解离的程度，也决定物质质点所带净电荷的多少。对蛋白质、氨基酸等两性电解质而言，pH值距等电点越远，质点所带净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢。因此，当分离某一蛋白质混合物时，应选择一个合适的pH值，使各种蛋白质所带净电荷的量差异较大，以利于分离。为了使电泳过程中溶液的pH值恒定，必须采用缓冲溶液。

（三）溶液的离子强度

离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于离子电荷的总数，而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢；离子强度越低，质点泳动的速度越快。一般最适合的离子强度在0.02~0.2之间。

在稀溶液中，离子强度的计算方法，是将每一离子浓度乘以其价数的平方，再将所有乘积相加，以2除其和。计算公式如下：

（四）电渗现象

液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象（图7-1）。例如，在纸电泳时，由于纸上带有负电荷，而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷，在电场的作用下溶液便向负极移动并带动着质点向负极移动。假如这时进行电泳，则质点移动的表面速度是质点移动速度和由于溶液移动而产生的电渗速度的加和。若质点原来向负极移动，则其表面速度比电泳速度快。若质点原来向正极移动，则其表面速度比电泳速度慢。

因此，在电泳时应尽量避免使用具有高电渗作用的支持物。

醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。

醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。

三、器材及试剂：

1．器材：

①醋酸纤维薄膜（2×8cm）

②常压电泳仪                                                         

③点样器（盖玻片）

④培养皿（染色及漂洗用）                                                

⑤粗滤纸

⑥玻璃板                                                  

⑦竹镊

⑧白磁反应板

⑨人血清或鸡血清                                                 

2．试剂：

①巴比妥缓冲液（PH8.6，离子强度0.07）：巴比妥2.76克，巴比妥纳15.45克，加水至1000毫升。

②染色液：含氨基黑10B0.25克，甲醇50毫升，冰醋酸10毫升，水40毫升（可重复使用）。

③漂洗液：含甲醇或乙醇45毫升，冰醋酸5毫升，水50毫升。

④透明液：含无水乙醇7份，冰醋酸3份。

四、操作步骤：

1．浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上用铅笔做上记号）放在缓冲液中浸泡20分钟。

2．点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器先在白磁板上的血清中沾一下，再在膜条一端2—3厘米处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。

3．电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。）膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。调节电压至160V，电流强度0.4—0.7毫安/厘米膜宽，电泳时间约为60分钟。

4．染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。

5．漂洗：将膜条从染色液中取出，置漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。

6．定量：有两种方法

（1）将上述漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下各种蛋白质色带，分别浸于4.0ml0.4mol·l^-1NaOH溶液中（37℃）5—10分钟，色泽浸出后，比色（590nm）。设各部分的光密度分别为：

（2）把薄膜放在滤纸上用电吹风吹干，待薄膜完全干燥后，浸入透明液中约5—10分钟，取出，平贴于干净玻璃片上，自然干燥或用电吹风冷风吹干，即得背景透明的电泳图谱，可用刀片刮开并从玻板上取下图谱。能用光密度计测定各蛋白斑点。此图谱可长期保存。

用本法测得血清蛋白各组分的正常值为：

白蛋白=67.24%（61.2—74.5%）

α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白=16.92%（11.2—22%）

γ球蛋白=15.84%（10.4—20.6%）