Wazard大量DNA纯化系统

碱法大量提取DNA往往需要很长的时间。Promega公司的Wiazrd大量DNA纯化系统既简单又快速，只需要离心和真空抽干，这个系统可以从500ml培养液中在3小时以内获得1mg以上的高质量的质粒DNA(200-20000bp)。该系统不需要酚和氯仿抽提，纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中，不含任何盐份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如RNasin）存在的条件下进行体外转录反应等。

该系统中含有的试剂和柱子可以用于10次100-500ml质粒培养液的分离和纯化，试剂包括: 150ml 细胞悬浮液，150ml 细胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA纯化树脂，125ml Wizard柱子洗脱溶液和10支Wizard带有存储离心管的柱子。

1、100-500ml细胞培养液置离心管中， 22-25℃下5000g离心10分钟， 所得细胞沉淀充分悬浮于细胞悬浮液中。

2、加15ml细胞裂解溶液并轻轻混合，可以反复倒置混合，但不能用涡旋振荡，细胞裂解完全时，溶液会变清，这一步需要20分钟。

3、加15ml中和溶液，立即反复倒置离心管数次，并使之混匀。

4、14000g，22-25℃离心15分钟。

5、小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。

6、加0.5倍体积的异丙醇，混合均匀， 14000g 22-25℃下离心15分钟。

7、弃上清，悬浮DNA沉淀于2ml TE缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。

8、加10ml Wizard大量DNA纯化树脂溶液， 并涡旋混合。

9、每一个样品，使用一支Wizard大量柱子，柱子的头插在真空器上(Promega产品，与此配套)。

10、将树脂/DNA混合液转入柱子中，真空抽取树脂/DNA混合液。

11、将树脂/DNA混合液抽干后，加13ml柱子洗脱溶液至离心管中， 对管底部的树脂/DNA进行洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液)，并加入柱子中。

12、真空抽干所加入的洗脱。

13、再加12ml柱子洗脱液进柱子并抽干。

14、加入5ml 80%乙醇漂洗柱中的树脂， 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管中，2500rpm(1300g)离心5分钟。

15、取出柱子，真空抽干5分钟，再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm(1300g)离心5分钟。

16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃预热过的灭菌重蒸水或TE，1分钟后2500rpm(1300g)离心柱子/离心管5分钟。

17、取出柱子，离心管中溶液即为提取的质粒DNA，可以直接放在离心管中，盖上盖子，储存在4℃或-20℃备用。

[注意] 1. 在使用之前，系统所提供的柱子洗脱液按1:1加入125ml 95％乙醇。

2. 纯化树脂必须混匀后再用.