梅毒螺旋体感染的诊断方法

梅毒螺旋体感染的诊断方法 一、微生物流行病学概况及主要临床表现 　　梅毒(Syhillis)是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum)引起的一种慢性全身性传染病.一经传染，螺旋体很快播散到全身，几乎可侵犯人体各器官，表现多种多样的类似很多疾病的临床表现，同时常时隐时现，病情变化难测，很容易造成误诊和漏诊.最早发现和论述梅毒病人的是在北美.一般认为梅毒起源于美洲.哥伦布的水手于1943年在北美染上梅毒后带回西班牙，很快在欧洲流行.后在交往中传到亚洲及世界各地，梅毒的传染途径有直接接触、间接接触和胎盘传染三种.直接接触传染又分为性直接接触和非性直接接触传染，其中性直接接触传染是梅毒传染的主要途径.此外，输血，特别是输入梅毒病人的新鲜血，也可以发生传染.一般根据梅毒传染途径不同，分为后天和先天梅毒.后天性(获得性)梅素是由皮肤或粘膜感染梅毒螺旋体而引起.其特点是症状反复出现，在疾病过程中也可以出现皮肤症状完全消退的潜伏期.根据其特点和经过，一般分为一期、二期和三期(晚期)梅毒.一期与二期梅毒传染性强，又称为早期梅毒，一般多在感染梅毒2年内.病期在2年以上者，临床为三期梅毒.几乎无传染性，但破坏性强，亦称晚期梅毒.一般梅毒的潜伏期为2～4周，患者一旦感染梅毒螺旋体后，经过潜伏期，即进入一期梅毒.主要临床表现是硬下疳，直至溃疡.所属淋巴结肿大等.二期梅毒:梅毒螺旋体在身体内大量散播后，所引起的全身性病理变化时期.主要表现在皮肤、粘膜、骨骼、内脏与神经系统中.三期梅毒:发生在感染后两年，是后天梅毒的一个阶段，可发生于潜伏性梅毒之病人，可累及身体的任何器官，表现几乎与任何部位的疾病相似.其特点:损害虽极少螺旋体，且几乎无传染性，但对组织、器官的破坏性大，功能影响严重.典型的损害是树胶肿，常发生在皮肤、粘膜，也可以发生于骨、软组织、食道、胃肠、肝、眼部等器官.胎传梅毒可以分早期与晚期梅毒.在2岁前发病者，为早期胎传梅毒;在2岁后发病者，为晚期胎传梅毒.先天性(胎传)梅毒是由已感染梅毒的母体，尤其在早期时，梅毒螺旋体可由血行通过胎盘传给体内胎内，临床表现大体上与后天梅毒相似，但仍有其特点:不发生硬下疳;早期病变较后天梅毒为重，而晚期则较轻;可影响患儿的正常发育和身体健康，死亡率高，等等. 二、病原体的分子生物学进展 　　应用分子生物学技术诊断梅毒主要有二个目的.①制备大量的螺旋体蛋白供血清诊断试验作抗原.②用多聚酶链式反应(PCR )从选择扩增选择的螺旋体DNA序列，从而使经选择的螺旋体DNA拷贝数量增加，能够用特异性探针来进行检测.

1、基因结构研究进展 　　Radlf等报道用重组DNA技术得到了分子量为190KD的4D膜蛋白抗原，进行间接ELISA试验，检测受试血清中抗螺旋体lgG抗体，显示特异性很强.以在大肠杆菌中表达的37KD螺旋体蛋白抗原，用放射免疫检测评价其诊断价值.Schouls等对二个重组DNA的产物42KD梅毒螺旋体膜蛋白A(TmpA)和34KD梅毒螺旋体膜蛋白B(TmpB)用于梅毒血清诊断进行了评价.Hay等对梅毒螺旋体的TmpA和4D基因519和428碱基对(bp)序列进行扩增，建立了PCR 检测脑脊液(CSF)中致病螺旋体的特异性DNA序列.Noordhoek等选择39KD基本膜蛋白基因作扩增，用PCR 检测神经梅毒患者CSF中的梅毒螺旋体DNA.Burstein等扩增了47KD膜蛋白中基因编码为658bp部分，用于通过杂交而检测扩增DNA的探针，由包括了扩增DNA中的一个大的496bp片段所组成.用这种方法作者能检出一些标本含有一条螺旋体的螺旋体DNA.

2、引物的设计部位与序列及其意义 　　目前有四套扩增梅毒螺旋体DNA的系统:扩增47KDa膜抗原基因(tpp47基因)、扩增39KDa碱性膜蛋白基因(bmp基因)、扩增TpF1蛋白基因(tpf-1)或TyF1蛋白基因(tyf-1)和扩增tmpA基因.

三种扩增系统的引物序列

CACAATGCTCACTGAGGATAGT ACGCACAGAACCGAATTCCTTG TTGTGGTAGACACGGTGGGTAC TGATCGCTGACAAGCTTAGGCT CAGGTAACGGATGCTGAAGT CGTGGCAGTAACCGCAGTCT GACCTGAGGACTCTCAAATC CTCAGCACTGCTGAGCGTAG AACGCCTCCATCGTCACACC CTCTTCAAGGAGCTCAT AGACAGTGGTTATGCTC ATTGCGCCAGCATGTAG ATTGCGCCGGCATGTAG 三、病原学检测现状(病原体、免疫学和PCR ) 　　密螺旋体病的确诊是很难的，因为四种病原性密螺旋体形态相同，免疫学上又关系密切.现尚未分出种特异性抗原，而且四种病的血清学反应相当类似.没有可用来鉴别的生化反应.用于诊断的四个指标是:地区分布、临床表现、暗视野镜检结果和血清学反应.聚合酶链式反应是目前最先进的检验技术之一，它具有高度敏感性和特异性，突出的优点是可检测到临床标本仅含有少量螺旋体的DNA，一些对PCR 的研究都集中在对先天梅毒和神经梅毒的诊断.

(一)梅毒螺旋体检查 　　用暗视野检查法检查病损内(即已采集到的渗出液、穿刺液或匀浆液)的梅毒螺旋体.这是一种最可靠的简单而常用的方法.免疫荧光检查法是一种可区别病损中的螺旋体是梅毒螺旋体或其他非致病螺旋体的方法，此法同样具有特异性.而银染色法是一种可显示内脏器官及皮肤损害中螺旋体的方法.但腐生螺旋体也可染色.因此是非特异性染色法.梅毒螺旋体不能进行体外培养.

(二)梅毒血清学诊断 　　目前，梅毒的血清学诊断方法有二类，一类为非梅毒螺旋体抗原检测反应素，包括快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)，性病研究实验所试验(VDRL)和不加热血清反应素试验(USR)等，另一类用密螺旋体抗原检测密螺旋体特异性抗体，包括荧光螺旋体抗体吸收成验(FTA-ABS)、梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)和梅毒螺旋体制动试验(TPI)等，以FTA-ABS试验最为常用.此外，还有酶免疫分析(EIA)和蛋白印迹试验(western blot assay).目前所采用的血清试验的缺陷是:对诊断潜伏期的一期梅毒、先天梅毒及神经梅毒的特异性与敏感性还不够强;不能鉴别性病与非性病螺旋体病.最近，WHO推荐用VDRL、RPR对患者血清进行过筛试验，然后用FTAABS试验进一步证实阳性血清.TPI可最后裁决可疑的反应，但是，除在非常情况下，不推荐使用制动试验，因为这需要获取新鲜活的密螺旋体(需要在兔体内大量滋长后获得).

(三)聚合酶链式反应 　　应用PCR 技术检测临床的各类标本和实验动物标本. 　　1、样品准备 　　1)采集 　　(1)临床标本:采取羊水、CSF和血清，贮存于-70℃1～7d作PCR 分析.在新生儿出生后1～3d(抗菌素处理前)，采取20～50μlCSF和100ul-2ml血液.血液凝固后通过离心(500g，10min)获得血清.(2)实验动物标本:取来自感染兔的拭子，放入无菌带盖试管内，不稀释(干拭子)，或浸入1ml无菌PBS或TE缓冲液中.穿刺活检组织标本或渗出液(10～20)ul直接与100μTE缓冲液混合，室温保存.来自感染动物的血液注入含肝素(20U/ml血液)或EDTA(14mg/5ml血液)试管内，按1ml/份分装，速冻，-30℃保存. 　　2)处理 　　(1)临床标本:为消除对PCR 的抑制，采用以下方法处理标本.①煮沸法:取10或20μl血清或CSF放入1.5ml微量离心管中，水浴煮沸10min后在冰浴中冷却，13000g离心10s，上清用作PCR 分析.②低速离心法:100μl羊水、血清或CSF于含1mol/LNacl，1mol/LNaOH和0.1%SDS的溶液中煮沸1.5min，同400μl0.5mol/LTris-HCl(pH8.0)中和.用相同体积的苯酚抽提，再以100μl0.15mol/LNaCl抽提苯酚.整个600μl的溶液用相同体积的氯仿:异戊醇(24∶1)抽提，然后用相同体积的异丙醇沉淀(-20℃过夜，13000g4℃离心15min，轻轻倒出上清，凉干.沉淀悬浮于51μl无菌水中，取1、10和40μl作PCR 分析. 　　(2)实验动物标本:50μl全血、血清或渗出物与50μl2X裂解缓冲液(LB)[1XLB含50moml/LTris-Hcl(pH8.5)，50mmol/LNacl，4mmol/LMgcl2，0.01%SDS，蛋白酶K(100μg/ml)I混合.活检组织用尖管压入100μl2XLB中，充分混匀.拭子浸入1mlPBS或TE缓冲液中稀释，加入10μl100mmol/LEDTA(PH8.0)，10μl10%SDS和10μl蛋白酶K(10mg/ml)，充分混匀，取50μl混入等量的2XLB.由于拭子标本和梅毒悬液中真核DNA浓度低，加入tRNA(100μg/ml)作为载体.以上处理的标本于55℃孵育1～2h或37℃过夜后，100℃加热15min以灭活蛋白酶K，然后保持在冰浴中.500g离心2min除去所有细胞碎片后，按Boom的方法提取DNA. 　　2.PCR 　　1)扩增47KDa膜抗原基因:100μl反应物含:10mmol/LTris-HCl(PH8.3)，50mmol/L KCl 3mmol/L MgCl₂ ，100μg/ml明胶，0.5μg引物(47-1和47-2)，75mmol/L dNTP，2.5U TaqDNA聚合酶.取不同量各种制备的DNA作模板.反应过程:94℃15s60℃1min，72℃1min，循环数40，未次循环增加或不增加延伸时间.取10μl反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析.点杂交分析产物，取10μlPCR 产物加入10μl0.5mol/LNaOH-1.5mol/LNaCl中变性10min，用380μl1.5mol/L NaCl- 10mmol/L Tris(PH7.2)中和，然后用MinifoldI点膜，80℃真空处理膜2h，用496bp探针65℃杂交过夜.探针由以47-3和47-4为引物的PCR 所得，用随机引物法标记. 　　2)扩增39KDa碱性膜蛋白基因:25μl反应体系含:RT缓冲液:50mmol/LTris-HCl(pH8.5)，50mmol/L NaCl，4mmol/L MgCl₂ ，2mmol/L DTT(二硫基苏糖醇)，200μmol/L dNTP，100μmol/L引物(TP7和TP8)，0.01%牛血清白蛋白(无DNase和RNaes)，0.6U TaqDNA聚合酶，5μl样品.可加入0.05mmol/L，四甲胺化氯增强PCR . 　　PCR 1:先用引物TP7和TP8扩增出617bp片段.反应过程:94℃3min后进入循环过程:94℃1min，65℃1min，72℃1min，循环数为30或39，每一循环中72℃延伸递增5s，最后一次延伸时间延长到6min. 　　PCR 2:再用巢居引物TP3和TP4扩增了500bp片段.PCR 1产物用蒸馏水稀释10倍，取5μl用作第二次扩增.PCR 2中Mgcl2和引物浓度分别为5mmol/L和20μmol/L引物(TP3和TP4)，其它条件与PCR 1相同. 　　PCR 产物分析.取8μl反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳，Southern印迹后，用寡核苷酸探针TP5(以32P作末端标记)杂交. 　　3)扩增TpF1蛋白基因或TyF1蛋白基因 　　100μl反应体系含:50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8.4)，2.5mmol/L MgCl₂ ，0.2mg/ml明胶，1μmol/LdNTP，0.2mmol/L引物(F1和F2)，2.5U TaqDNA聚合酶，10μl经处理的兔睾丸梅毒螺旋体悬液.反应过程:94℃1min，55℃1.5min，72℃2.5min，循环数为40.取10μlPCR 产物用2%琼脂糖凝胶电泳，Southern印迹后，用tpf-1特异的探针F3和tyf-1特异的探针F4分别杂交. 四、PCR 应用的评价 　　梅毒螺旋体不能进行体外培养.检测临床标本中梅毒螺旋体最敏感、可靠的方法是兔感染试验(RIT).RIT能证实活的梅毒螺旋体存在，能检测单个螺旋体，被称为鉴定临床标本中梅毒螺旋体的“gold standard”.然而用RIT对新生儿或成人梅毒进行常规诊断不切合实际.梅毒的血清学诊断对确定感染及治疗很有意义，但对早期梅毒诊断不敏感，对先天性及神经性梅毒的诊断不够特异.Burstain和Grimprel等人将PCR 技术用于先天梅毒的诊断中，发现其敏感性和特异性均优于血清学方法.高度敏感性使PCR 方法尤其适用于微量梅毒螺旋体的检测如先天梅毒、早期梅毒，有报导感染后10天左右皮损刚一出现即可检出阳性;良好的特异性使PCR 技术在梅毒和其它螺旋体感染的鉴别诊断、梅毒螺旋体的病原学研究方法具有重要作用;艾滋病患者感染梅毒后可出现多种异常的免疫学变化，对梅毒的血清学反应延迟出现甚至完全消失，此时应用PCR 方法检测组织中病原体将显示出独特价值.但PCR 方法并不能取代梅毒的血清学反应，Wicher等认为若病人下疳愈合，血清学反应阳性时无需再做PCR 检测. 　　Grimprel证实，理论上PCR 检测梅毒螺旋体的敏感性与RIT相同.将PCR 应用于检测羊水(含有相对多的梅毒螺旋体数量)时，与RIT比较，其敏感性为100%;应用于血清和CSF标本(含有梅毒螺旋体的量可能较少)时，PCR 的敏感性就不如RIT.Hay报道，用PCR 可以半数以上的潜伏梅毒和三期梅毒病人CSF中检测到梅毒螺旋体，这与用RIT对后期梅毒分析的报道不一致，且未经RIT证实.因此，在确认PCR 对梅毒正确诊断前，须将PCR 与RIT的结果作临床比较.Noordhoek在病人抗菌素治疗前和治疗后不同时相取其CSF，用PCR 研究CSF中梅毒DNA存在情况.结果表明:DNA很稳定，在静注青霉素治疗杀死梅毒螺旋体后，这种DNA在CSF中可遗留较长时间.因此，在检查抗菌素对神经梅毒患者治疗效果时，PCR 的使用受到限制.PCR 也被用作分子探针来进一步了解先天性梅毒的发病机理.例如，用PCR 可以决定是否婴儿螺旋体血症是持续的，已持续多久，以及血清和CSF中存在梅毒螺旋体的关系.仍不清楚对新生儿CSF中梅毒螺旋体确认后的临床预后和治疗，但PCR 是诊断和评价新生儿神经梅毒有价值的手段.当其它方法对梅毒螺旋体感染的诊断无效时，PCR 显示其优点.乱交者是HIV和梅毒螺旋体感染的高危人，在这种情况下，血清学试验检测无效.用PCR 对患者CSF检查是证实梅毒螺旋体感染的唯一方法. 五、应用PCR 技术进行进一步深入研究的课题及方向 　　为使扩增效率达到最大，反应参数应选择最佳数值，从而增加PCR 的敏感性.使用大段双股DNA探针检测PCR 产物，而不用合成的寡核苷酸探针，因为这样可通过标记得到较高、特异的放射活性.另外，大段探针能最大减少野生株tpp47可变序列的假阴性结果及由于TaqDNA聚合酶的错误导致碱基替代的假阴性结果.实验证实:PCR 的敏感性确能达到检测单一tpp47拷贝的水平.已证实PCR 检测纯梅毒螺旋体或其DNA很敏感，但是当PCR 用于临床标本时，标本会抑制对梅毒螺旋体DNA的扩增.因此需要作以下两方面的研究:①改进处理标本的方法以消除对PCR 的抑制因子;②回顾性地比较PCR 和RIT结果.由于临床标本可能含有大量人细胞和微生物，建立对梅毒螺旋体高度特异的PCR 方法是很重要的.尽管大量数据支持47KDa膜抗原基因及其相应基因具梅毒螺旋体特异性，还应深入研究该方法的特异性. >

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