互联网2013-11-13
Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm／kg H２ O)，粘度也很小，可形成高达1.3g／mL密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
1. 小牛血清
2. Percoll细胞分离液
3. 8.5％NaCl
4. 1.5MPBS
1. 高速冷冻离心机(3K-30)
2. 4℃、-20℃冰箱
3. 长针头注射器
4. 1.5mL和10mL离心管
PBMC细胞
1. 不同浓度(密度)Percoll溶液的制备: 先用9份Percoll与1份8.5％ NaCl或1.5M PBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。
2. 不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。
3. 装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。
4. 离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。
5. 取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞；有时大部分细胞位于Percoll层中，则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。
举例：
1. 富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化：按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五种不同密度的Percoll，如用10mL试管(或塑料管)分离，每层Percoll约1.2～1.5mL，初步从外周血中分离的PBMC细胞1×108 悬于1mL培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5％与45％Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。
2. 纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50％和30％Percoll液。收取经PHA(或其它抗原、有丝分裂原)刺激PBMC，或含有较高比例异型的PBMC(如肾综合征出血热患者)，按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。
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