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    高效感受态细胞的制作

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    实验试剂

     

    SOB 培养基

    SOC 培养基

    LB 培养基

    DMSO（国产分析纯）

    TB缓冲液

    液氮

    实验步骤

     

    1. 方法一
      1) 划线得到单菌落，37℃培养箱培养约17小时；
      2) 挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶，37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时；
      3) 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多；
      4) 每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮；
      5) 加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟；
      6) 用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
    注：效率非常高，一般可到108 ，好时可到109 ，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

    2. 方法二

       1) 液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌E.coli DH5α，JM109，HB101等，在LB平板上划线，37℃过夜至长出单菌落；

       2) 挑直径1-3毫米的单菌落可多个，接种到250毫升/3升锥形瓶或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基，培养基量不可再多，会影响效率；
       3) 在18℃ 150-250RPM 培养19-50小时没有冷却摇床的可在室温，但不可高于37度；
       4) OD600约0.4-0.8时停止培养，放在冰水中冷却10分钟；
       5) 4℃，300RPM离心15分钟，回收菌体；
       6) 去掉上清后，用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮，在冷10分钟；
       7) 再次离心回收菌体；
       8) 用1/12.5体积的TB悬浮，添加最终浓度为7%的DMSO，再冷却10分钟；
       9) 0.1-1毫升分装，直接在液氮中冻上；
     10) 在液氮或-80℃保存。
     
    3. 方法三
       1) 将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化；
       2) 挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养；
       3) 当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体；
       4) 用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体；
       5) 重复第4步操作；
       6) 用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% ；
       7) 冰浴10min后，分装保存于液氮中。
    注：本法效率极高，建议采纳。

    注意事项

     


    1. 所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。
    2. 培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。
    3. 培养基的pH值。这是讲的pH值并非单指配置或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2，等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。
    4. 培养后的OD值。其实这并一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6，0.8等等。同时，OD值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。
    5. 培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2 离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用20mM MgCl2 做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。
    6. 培养温度。文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。
    7. 此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。
    8. 液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱，这点未做实验，只是一种感觉，第一次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。

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