固相萃取与固相微萃取

固相萃取(Solid Phase Extraction  SPE)就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。  
    与液－液萃取相比固相萃取有很多优点：固相萃取不需要大量互不相溶的溶剂，处理过程中不会产生乳化现象，它采用高效�高选择性的吸附剂（固定相），能显著减少溶剂的用量，简化样品于处理过程，同时所需费用也有所减少。一般说来固相萃取所需时间为液－液萃取的1/2，费用为液－液萃取的1/5。其缺点是：目标化合物的回收率和精密度要低于液－液萃取。
一． 固相萃取的模式及原理
    固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其主要分离模式也与液相色谱相同，可分为正相（吸附剂极性大于洗脱液极性），反相（吸附剂极性小于洗脱液极性），离子交换和吸附。固相萃取所用的吸附剂也与液相色谱常用的固定相相同，只是在粒度上有所区别。
    正相固相萃取所用的吸附剂都是极性的，用来萃取（保留）极性物质。在正相萃取时目标化合物如何保留在吸附剂上，取决于目标化合物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间相互作用，其中包括了氢键，π―π键相互作用，偶极－偶极相互作用和偶极－诱导偶极相互作用以及其他的极性－极性作用。正相固相萃取可以从非极性溶剂样品中吸附极性化合物。
    反相固相萃取所用的吸附剂通常是非极性的或极性较弱的，所萃取的目标化合物通常是中等极性到非极性化合物。目标化合物与吸附剂间的作用是疏水性相互作用，主要是非极性－非极性相互作用，是范德华力或色散力。
    离子交换固相萃取所用的吸附剂是带有电荷的离子交换树脂，所萃取的目标化合物是带有电荷的化合物，目标化合物与吸附剂之间的相互作用是静电吸引力。
固相萃取中吸附剂（固定相）的选择主要是根据目标化合物的性质和样品基体（即样品的溶剂）性质。目标化合物的极性与吸附剂的极性非常相似的时，可以得到目标化合物的最佳保留（最佳吸附）。两者极性越相似，保留越好（即吸附越好），所以要尽量选择与目标化合物极性相似的吸附剂。例如：萃取碳氢化合物（非极性）时，要采用反相固相萃取（此时是非极性吸附剂）。当目标化合物极性适中时，正�反相固相萃取都可使用。吸附剂的选择还要受样品的溶剂强度（即洗脱强度）的制约。
    样品溶剂的强度相对该吸附剂应该是较弱的，弱溶剂会增强目标化合物在吸附剂上的保留（吸附）。溶剂强度在正�反固相萃取中的顺序是不同的（见图3―13）。如果样品溶剂的强度太强，目标化合物将得不到保留（吸附）或保留很弱。例如：样品溶剂是正己烷时用反相固相萃取就不合适了，因为正己烷对反相固相萃取是强溶剂（见图3―13），目标化合物将不会吸附在吸附剂上；当样品溶剂是水时就可以用反相固相萃取，因为水对反相固相萃取是弱溶剂，不会影响目标化合物在吸附剂上的吸附。
固相萃取选择分离模式和吸附剂时还要考虑以下几点：
1. 目标化合物在极性或非极性溶剂中的溶解度，这主要涉及淋洗液的选择。
2. 目标化合物有无可能离子化（可用调节pH 值实现离子化），从而决定是否采用离子交换固相萃取。
3. 目标化合物有无可能与吸附剂形成共价键，如形成共价键，在洗脱时可能会遇到麻烦。
4. 非目标化合物与目标化合物在吸附剂上吸附点上的竞争程度，这关系到目标化合物与干扰化合物是否能很好分离。
二． 固相萃取常用的吸附剂（固定相）
    鉴于固相萃取实质上是一种液相色谱的分离，故原则上讲，可作为液相色谱柱填料的材料都可用于固相萃取。但是，由于液相色谱的柱压可以较高，要求柱效较高，故其填料的粒度要求较严格，过去常用10μm粒径填料，现在高效柱多用5μ的m填料，甚至用了3μm的填料（随着HPLC泵压的提高，填料的粒径在逐渐减小）。对填料的粒径分布要求也很窄。固相萃取柱上所加压一般都不大，分离目的只是把目标化合物与干扰化合物和基体分开即可，柱效要求一般不高，故作为固相萃取吸附剂的填料都较粗，一般在40μm即可用，粒径分布要求也不严格，这样可以大大降低固相萃取柱的成本。常用于固相萃取的吸附剂类型及用途参见表3―4。
三． 固相萃取的装置及操作程序
最简单的固相萃取装置就是一根直径为数毫米的小柱（图3―14），小柱可以是玻璃的，也可以是聚丙稀�聚乙烯�聚四氟乙烯等塑料的，还可以是不锈钢制成的。小柱下端有一孔径为20μm的烧结筛板，用以支撑吸附剂。如自制固相萃取小柱没有合适的烧结筛板时，也可以用填加玻璃棉来代替筛板，起到既能支撑固体吸附剂，又能让液体流过的作用。在筛板上填装一定量的吸附剂（100�~1000�，视需要而定），然后在吸附剂上再加一块筛板，以防止加样品时破坏柱床（没有筛板时也可以用玻璃棉替代）。目前已有各种规格的�装有各种吸附剂的固相萃取小柱出售，使用起来十分方便（图3―15）。
    固相萃取的一般操作程序如下：
1．活化吸附剂：在萃取样品之前要用适当的溶剂淋洗固相萃取小柱，以使吸附剂保持湿润，可以吸附目标化合物或干扰化合物。不同模式固相萃取小柱活化用溶剂不同：
（1）反相固相萃取所用的弱极性或非极性吸附剂，通常用水溶性有机溶剂，如甲醇淋洗，然后用水或缓冲溶液淋洗。也可以在用甲醇淋洗之前先用强溶剂（如己烷）淋洗，以消除吸附剂上吸附的杂质及其对目标化合物的干扰。
（2）正相固相萃取所用的极性吸附剂，通常用目标化合物所在的有机溶剂（样品基体）进行淋洗。
（3）离子交换固相萃取所用的吸附剂，在用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来淋洗；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂淋洗后，再用适当PH 值的�并含有一定有机溶剂和盐的水溶液进行淋洗。
为了使固相萃取小柱中的吸附剂在活化后到样品加入前能保持湿润，应在活化处理后在吸附剂上面保持大约1ml活化处理用的溶剂。
     2．上样：将液态或溶解后的固态样品倒入活化后的固相萃取小柱，然后利用抽真空（图3―16），加压（图3―17）或离心（图3―18）的方法使样品进入吸附剂。                    
   3． 洗涤和洗脱：在样品进入吸附剂，目标化合物被吸附后，可先用较弱的溶剂将弱保留干扰化合物洗掉，然后再用较强的溶剂将目标化合物洗脱下来，加以收集。淋洗和洗脱同前所述一样，可采用抽真空，加压或离心的方法使淋洗液或洗脱液流过吸附剂。
如果在选择吸附剂时，选择对目标化合物吸附很弱或不吸附，而对干扰化合物有较强吸附的吸附剂时，也可让目标化合物先淋洗下来加以收集，而使干扰化合物保留（吸附）在吸附剂上，两者得到分离。图3―19给出了两种方法的示意图。在多数的情况下是使目标化合物保留在吸附剂上，最后用强溶剂洗脱，这样更有利于样品的净化。图3―20给出了固相萃取
所采用的一般程序示意图。                                               
为了方便固相萃取的使用，很多厂家除了生产各种规格和型号的固相萃取小柱之外，还研制开发了很多固相萃取的专用装置，使固相萃取使用起来更加方便简单。如Supelco公司提供了给单个固相萃取小柱加压的单管处理塞（图3―21），可方便的与固相萃取小柱配套使用。又如，为了能使多个固相萃取小柱同时进行抽真空，Supelco公司提供了12孔径和24孔径的真空多歧管装置（图3―22），可同时处理多个固相萃取小柱。我国中科院大连化学物理研究所，国家色谱研究分析中心也研制开发了真空固相萃取装置。
         
图3―23 给出了如何根据样品的基体（溶剂），目标化合物和干扰化合物的性质来选择固相萃取模式的流程图
四． 固相微萃取(Solid phase Micro-Extraction  SPME)
固相微萃取是在固相萃取基础上发展起来的一种新的萃取分离技术，与液―液萃取和固相萃取相比，具有操作时间短，样品量小，无需萃取溶剂，适于分析挥发性与非挥发性物质，重现性好等优点。很多研究结果表明，在样品中加入适当的内标进行定量分析时，其重现性和精密度都非常好。固相微萃取装置外型如一只微量进样器，由手柄（holder）和萃取头或纤维头（fiber）两部分构成，萃取头是一根1�长，涂有不同吸附剂的熔融纤维，接在不锈钢丝上，外套细不锈钢管（保护石英纤维不被折断），纤维头在钢管内可伸缩或进出，细不锈钢管可穿透橡胶或塑料垫片进行取样或进样。手柄用于安装或固定萃取头，可永远使用（图3―24）

固相微萃取关键在于选择不石英纤维上的涂层（吸附剂），要使目标化合物能吸附在涂层上，而干扰化合物和溶剂不吸附，一般是：目标化合物是非极性时选择非极性涂层；目标化合物是极性时选择极性涂层。
固相微萃取的采样方法是将固相微萃取针管（不锈钢套管）穿过样品瓶密封垫，插入样品瓶中。然后推出萃取头，将萃取头浸入样品（浸入方式）或置于样品上部空间（顶空方式），进行萃取。萃取时间大约2―30分钟，以达到目标化合物吸附平衡为准。最后缩回萃取头，将针管拔出（图3―25）。
固相微萃取可用于气相色谱，也可用于液相色谱（图3―25）。用于GC时，是将固相微萃取针管（不锈钢套管）插入GC进样口，推手柄杆，伸出纤维头，使用进样口的高温热解吸目标化合物，解吸后被载气带入色谱柱。用于HPLC时，是将固相微萃取针管（不锈钢套管）插入固相微萃取/HPLC接口解吸池，然后再利用HPLC的流动相通过解吸池洗脱目标化合物，并将目标化合物带入色谱柱。
                                                      
五． 固相萃取的应用
固相萃取主要用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的分离和富集。例如，生物体液（如血液，尿等）中药物及其代谢产物的分析，食品中有效成分或有害成分的分析，环保水样中各种污染物（可挥发性有机物和半挥发性有机物）的分析都可使用固相萃取将目标化合物分离出来，并加以富集，然后进行色谱分析。下面举两个具体分析实例加以说明。
1． 血浆中苯并二氮杂草类药物（安定）的测定
使用6ml的固相萃取柱，柱内填加500�C18吸附剂。用5ml甲醇活化，然后再用5ml水淋洗。将1ml 0.1M醋酸钠加入4ml血浆中，充分混合后倒入萃取柱内，抽滤。然后加入3ml水，抽滤30秒。再将固相萃取柱在1000~1500rpm离心机上离心5分钟。用3ml丙酮洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在氮气流下缓缓加热（<45℃）至干燥。用200μl甲醇溶解残渣，进样20μl，进行HPLC分析。
HPLC条件： 柱子: ODS-3   5μm  150×4.6mm
            流动相:乙腈/甲醇/5mMKH2PO4(15/30/55）
            流速: 2ml/min            
            柱温: 40℃
            检测器: UV254
实验结果见图3―26和表3―5      
2． 水中多环芳烃（PAHS）的测定
使用6ml固相萃取柱，柱内填加500mgC18吸附剂，用5ml二氯甲烷活化, 然后再用5ml甲醇和5ml水重复一次。加2ml异丙醇到20ml水样中（10%异丙醇含量）， 混合后倒入固相萃取柱，流速不得大于10ml/min。用3ml甲醇/水（50/50）淋洗，抽真空30秒，再将固相萃取柱在1000~1500rpm离心机上离心5分钟。用3ml二氯甲烷洗脱，收集洗脱液。将洗脱液在干燥氮气流下浓缩到50~200μl，浓缩时样品不要加热，以免造成小分子多环芳烃的丢失。加二氯甲烷至总体积为200μl，进样20μl，进行GC分析。
GC条件： 柱DB-5   30m×0.25mmID  0.25μ    载气：氮气  线速度为35cm/秒 (65℃)
程序升温：65℃停留1分钟后以25℃/分的升温速率升至140℃，然后以10℃/分的升温速
率升至290℃，在290℃停留25分钟。进样：275℃  不分流进样，吹扫45秒
检测器：FID  300℃   尾吹氮气30ml/分     实验结果见图3―27和表3―6