电化学脱氧核糖核酸传感器进展

电化学DNA传感器的发展在过去短短几年里倍受重视［1］。它是一种全新的特定DNA序列(基因)检测技术，它与通常的标记(放射性同位素标记，荧光标记等)探针技术相比，具有选择性好、灵敏度高、响应快、操作简便、价格低廉等特点，可望用于临床上基因疾病的快速检验，用于探讨各种因素引起DNA损伤的程度和可能的突变机理，用于以DNA为作用靶的药物研究。因此，虽然电化学DNA传感器才有几年的历史，但已有了很大的进展。本文将对电化学DNA传感器研究进展进行评述。
1　电化学DNA传感器原理
　　电化学DNA传感器是由一个支持DNA片段(探针)的电极和检测用的电活性杂交指示剂(hybridization indicator)构成。DNA探针是单链DNA(ssDNA)片段(或者一整条链)，长度从十几个到上千个核苷酸不等，它与靶序列(target sequence)是互补的，一般多采用人工合成的短的寡聚脱氧核苷酸作为DNA探针。通常是将ssDNA(探针分子)修饰到电极表面构成DNA修饰电极。由于ssDNA与其互补靶系列杂交具有高度的序列选择性，使得这种ssDNA修饰电极呈现极强的分子识别功能。在适当的温度、pH、离子强度下，电极表面的DNA探针分子能与靶序列选择性地杂交，形成双链DNA(dsDNA)，从而导致电极表面结构的改变。这种杂交前后的结构差异，可以通过具有电活性的杂交指示剂来识别，这样便达到了检测靶序列(或特定基因)的目的。
2　DNA修饰电极的制备及其特点
　　DNA修饰电极所使用的基底电极有玻碳电极，金电极，碳糊电极和裂解石墨电极等。目前制DNA修饰电极主要有3种方法：吸附法、共价键合法和组合法。
2.1　吸附法
2.1.1　化学吸附法
　　Joseph Wang等［1，2］发展了一种简单DNA修饰电极的方法。将碳糊电极(carbon paste electrode)放到含DNA探针分子的搅拌的醋酸缓冲溶液中于1.7 V(vs.Ag/AgCl)的电位下活化电极1 min，然后在0.5 V的电位下吸附富集探针分子2 min，最后用0.75 moundefinedL-1 NaCl的磷酸缓冲溶液淋洗10 s，便对DNA探针分子进行了固定。
　　庞代文等也发展了一种简便制备DNA修饰电极的方法。将ssDNA溶液转移至经过抛光、活化、超声波清洗的玻碳电极［3］或金电极［4～6］表面，涂匀，空气中放干，无菌2次水冲洗，充分浸泡(多于24 h)，即得到几乎单分子层的DNA修饰电极。该法制得的修饰电极浸泡3天，信号基本不变，表明得到的修饰层相对稳定，耐酸能力较强，耐碱能力较差。
　　化学吸附法的优点是简单，但该法得到的DNA修饰电极仅是相对稳定，且不利于分子杂交。
2.1.2　自组装膜法
　　基于分子自组作用，在固体表面自然形成高度有序的单分子层的方法称自组装膜法。制备DNA修饰电极多采用巯基化合物在金表面的自组作用。
　　Maeda等［7］利用DNA的5′末端的磷酸基与2-羟乙基二硫化合物的羟基反应生成磷酸酯键，将反应混合物通过凝胶柱分离，得到纯的5′末端修饰的DNA，再通过巯基将修饰DNA固定于金电极表面，得到DNA修饰电极。Hashimoto等［8,9］在ssDNA　5′末端修饰巯己基，通过巯基将ssDNA固定在金电极上。Bard等［10，11］则通过巯丁基磷酸在金电极上的有序吸附和反应步骤，制备出一层有序的链烷磷酸铝膜，膜中含有金属中心离子Al3+，能与带负电的DNA链强烈作用，将DNA固定于电极表面，得到DNA修饰电极。
　　自组装膜法制得的DNA修饰电极，表面结构高度有序，稳定性好，有利于杂交，但对巯基化合物修饰的DNA的纯度要求较高，分离提纯操作较繁琐。
2.2　共价键合法
　　共价键合法一般分2步进行。第1步是电极的活化预处理，以引入活性键合基团；第2步进行表面的有机合成，通过共价键合反应把探针分子修饰到电极表面。
　　Millan等［12］研究发现，在氧化的玻碳电极表面，以一种水溶性的乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-烃基磺基琥珀酰亚胺(NHS)作偶联活化剂，变性的小牛胸腺DNA和多聚脱氧鸟苷酸多聚脱氧胞苷酸［poly(dG)poly(dC)］片段通过与活化的电极表面(O-酰基异脲)形成磷酰胺键共价结合到电极表面，而未变性的小牛胸腺DNA和多聚脱氧腺苷酸多聚脱氧胸腺苷酸［poly(dA)poly(dT)］则不能结合上去。进一步研究表明DNA是通过dG残基选择性地共价结合到电极表面，因此他们利用末端脱氧核苷酸转移酶在脱氧核苷酸3′末端处用dG残基将ssDNA共价结合到电极表面。
　　方禹之等［13］报道通过硅烷化试剂在石墨电极表面导入氨基(-NH2)，在EDC存在下，-NH2与DNA的5′末端磷酸基缩合而共价到电极表面。
　　共价键合法制备的DNA修饰电极，得到稳定的修饰层，易进行分子杂交，但由于电极表面活性位点少，表面合成又是异相反应，因而固定的DNA量少，响应信号较小。
2.3　组合法
　　该法是将化学修饰剂与电极材料(石墨粉)混合以制备组合修饰电极。Millan等［14］将18-烷基胺混入碳糊中，得到修饰的碳糊电极。在EDC存在下，18-烷基胺的氨基与ssDNA 5′末端的磷酸基形成磷酸酰氨键，而将DNA固定到电极上，或者在EDC和NHS共存下，ssDNA通过dG残基与碳糊电极中的18-烷基酸结合而修饰到电极上。
　　组合法制备的DNA修饰电极，得到的修饰层稳定，且易于分子杂交，响应信号较共价键合法好，但经杂交后形成的DNA传感器再生能力差。当用热的去离子水冲洗时，仅在开始的1次、2次获得满意的效果，在进行了多于2次杂交后就较难再用去离子水再生了［14］。
　　理想的核酸修饰电极制备方法应简单，得到的修饰层稳定、响应灵敏、易于杂交、再生能力强等。
3　杂交指示剂的研究
　　杂交指示剂是一类能与ssDNA和dsDNA以不同方式相互作用的电活性化合物，且其还原电位处于DNA的电化学窗口之中(+1.2～-0.9V，vs.SCE)。当它与DNA结合后，发生可逆的氧化还原反应时，可与DNA发生电子交换，而DNA通过远程电子传递而使指示剂与电极发生电子交换完成电化学反应过程。
3.1　杂交指示剂和DNA的结合方式与电化学响应的关系
　　杂交指示剂与DNA的结合方式有3种基本的模式。第1种是指示剂分子与DNA分子的带负电荷的脱氧核糖-磷酸骨架之间通过静电作用而相互结合，即静电结合(electrostatic binding)；第2种是指示剂分子依靠碱基的疏水作用在沟面与DNA分子相互作用而结合，即面式结合(surface binding)；第3种是指示剂分子依靠氢键、范德华力和堆积作用插入DNA分子双螺旋的碱基对之间，即插入作用(intercalation)。
　　Bard等［15～17］研究了外源分子(实质上是杂交指示剂)与DNA之间的相互作用方式对外源分子的循环伏安行为的影响，指出插入指示剂不仅能通过插入结合与dsDNA作用，而且也能通过静电结合与ssDNA相互作用，因此，一个适合电化学DNA传感器的指示剂应该对dsDNA比对ssDNA具有更高的选择性结合能力。由于dsDNA和ssDNA对指示剂具有预富集作用，因此，电流响应增加。但由于指示剂与dsDNA和ssDNA选择性结合能力上有差别，因此在dsDNA和ssDNA修饰电极上富集程度不同，也就是电流响应不一样，即插入指示剂对dsDNA的选择性结合可通过电流的响应而间接地加以测量。
3.2　杂交指示剂的类型
　　使用杂交指示剂主要有2种类型。第1类是过渡金属配合物，例如由平面多吡啶配体(已研究的主要是2，2-联吡啶和1，10-邻菲咯啉)配位的过渡金属Co3+和Os2+［15～17］八面体手性配合物和四(N-甲基吡啶基)卟啉锰(Ⅲ)［Mn(Ⅲ)TMPyP］［18］；第2类是带刚性大平面芳香环化合物，例道诺霉素抗癌药物(daunomycin anticancer drug)［9，19～21］、盐酸阿霉素［22］、水溶性meso-四(4-三甲胺基苯基)卟啉(H2TMAP)［23］、米托蒽醌［24］、Hoechst 33258［8］等。
　　目前的研究发现道诺霉素在dsDNA修饰电极上比在ssDNA修饰电极上峰电位有比较明显的正移，二者的峰电位差约34 mV，证明了道诺霉素在与dsDNA和ssDNA的结合方式上有较明显的差别，因此，道诺霉素可以用来识别dsDNA和ssDNA，即可做为杂交指示剂。在用它做为指示剂检测靶基因时，检测限达10-8 undefinedmL-1。然而，这对低于pg级(10-12)的痕量靶基因分析的要求还有一定的距离。这主要与杂交指示剂的选择、杂交指示剂直接与电极的非特性吸附、杂质的干扰等因素有关。Hashimoto等［6］在磷酸缓冲底液进行检测，从而避免了指示Hoechst 33258的非特性吸附和杂质的干扰。其结果显示，靶DNA的浓度在10-7～10-13 undefinedmL-1范围内与杂交指示剂电氧化的峰电流线性相关。
4　电化学DNA传感器的应用
　　人类的遗传病和某些传染病的早期诊断基于已知非正常碱基序列DNA的测定。电化学DNA传感器可快速检测特定DNA序列和痕量基因分析。
　　Millan等［12］以Co(bpy)3(ClO4)3或Co(phen)3(ClO4)3为杂交指示剂，oligo(dT)20探针经(dG)延长被固定在玻碳电极上，与其互补的oligo(dA)20杂交后，通过循环伏安法(CV)测定杂交指示剂响应的增大来检测靶序列。杂交后的电极可用热的去离子水冲洗而再生，反复杂交再生，传感器性能稳定。当使用碳糊电极进行DNA传感器的研究时发现：在低的离子强度下，杂交缓慢(t≥1 h)；而高的离子强度，杂交快速(t≤10 min)。采用高离子强度，poly(dA)4000的检出限为2.5 ng。该结果用于选择性测定18个碱基长度的囊性纤维变性基因ΔF508序列，结果满意。但该传感器难以再生使用。
　　Bard等［10，11］将电　致化学发光(ECL)与ssDAN修饰电极相结合进行基因传感器研究。　用Ru(phen)2+3标记与探针互补的靶序列，杂交后产生Ru(phen)2+3标记的dsDNA，杂交程度由ECL测定。未用标记的DNA杂交，通过加入与dsDNA发生作用的Ru(phen)2+3，测定其ECL来检测同源序列，并对8个碱基的靶序列进行了检测。
　　Joseph Wang等［25］提出以肽核酸代替ssDNA探针分子进行基因传感器的研究发现，电极表面的肽核酸仍保持其在溶液中专一、有效的杂交特性。与ssDNA识别层相比，肽核酸层使基因传感器具有更优越的性能。他们最近报道了一种用于人类免疫缺陷病毒Ⅰ(HIV)相关的短DNA序列测定的传感器。将来源于HIV-Ⅰ ULTR序列的含有21或42个碱基的单链寡聚核苷酸部分修饰到碳糊电极上，以指示剂Co(phen)2+3的计时电位信号转换模式监测(PSA)的计时电位峰来测定杂交，HIV-Ⅰ U5LTR片段的检出限为4×10-9 moundefinedL-1。
　　电化学DNA传感器也可用于DNA损伤的研究中［19］。方禹之等利用ssDNA分子共价固定在石墨电极表面，以道诺霉素作为杂交指示剂，研究了在不同致突变(紫外光照射、亚硝酸作用、超声波作用)作用下，特定碱基序列的DNA在电极表面能否杂交及杂交程度的差异。
　　还值得指出的是，Fawcett等［26～28］利用电化学石英天平对杂交时间、杂交温度、DNA传感器的再生等方面进行了研究，获得了较为满意的结果。
6　展望
　　综上所述，电化学DNA传感器具有重要的理论意义和应用价值。它被认为是开辟了电化学与分子生物学交叉学科的新领域，为生命科学的研究提供了一种新方法。它将成为生物电化学的一个非常有生命力的前沿领域。
　　今后电化学DNA传感器的研究工作将会集中在：(1)适合于高灵敏检测的杂交指示剂的筛选研究；(2)电极结构的优化，稳定的自组装单分子层修饰电极在电化学DNA传感器的研究中将会被广泛应用；(3)电化学DNA传感器在疾病基因的诊断上的应用；(4)电化学石英晶体微天平DNA传感器的研究；(5)一些药物作为杂交指示剂研究与DNA的相互作用；(6)应用电化学DNA传感器研究DNA的损伤因素。

李红（中山大学化学与化学工程学院　广州　510275）
计亮年（中山大学化学与化学工程学院　广州　510275）
李红（华南师范大学化学系　广州　510631）

参考文献

1，Wang J,Chicharro M,Rivas G,et al.DNA biosensor for the detection of hydrazines.Anal Chem,1996,68:2251
2，Wang J,Cai X-H,Rivas G,et al.DNA electrochemical biosensor for the detection of short DNA sequences related to the human immunodeficiency virus.Anal Chem,1996,68:2629
3，Pang D-W,Zhang M,Wang Z-L,et al.Modification of glassy carbon and glod electrodes with DNA.J Electroanal Chem,1996,403:183
4，Zhao Y-D,Pang D-W,Wang Z-L,et al.DNA -modified electrodes.Part 2.Electrochemical characterization of gold electrodes modified with DNA.J Electroanal Chem,1997,431:203
5，Pang D W,Abruna H D.Micromethod for investigation of the interactions between DNA and redox-active molecules.Anal Chem,1998,70:3162
6，Brett C M A,Brett A M O,Serrano S H P.An EIS study of DNA-modified electrodes.Electrochim Acta,1999,44:4233
7，Maeda M,Nakano K,Uchida S,et al.Mg2+ -selective electrode comprising double-helical DNA as receptive entity.Chem Lett,1994,1805
8，Hashimoto K,Ito K,Ishimori Y,et al.Sequence-specific gene detection with a gold electrode modified with DNA probes and electrochemically active dye.Anal Chem,1994,66:3830
9，Herne T M,Tarlov M J.Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces.J Am Chem Soc,1997,119:8916
10，Xu X-H,Yang H C,Mallouk T E,et al.Immobilization of DNA on an aluminum (Ⅲ) alkanebisphosphonate thin film with electrogenerated chemiluminescent detection.J Am Chem Soc,1994,116:8386
11，Xu X-H,Bard A J.Immobilization and hybridization of DNA on an aluminum (Ⅲ) alkanebisphosphonate thin film with electrogenerated chemiluminescent detection.J Am Chem Soc,1995,117:2627
12，Millan K M,Mikkelsen S R.Sequence-selective biosensor for DNA based on electroactive hybridization indicators.Anal　Chem,1993,65:2317
13，Liu S-H,Ye J-N,He P-G,et al.Voltammetric determination of sequence-specific DNA by electroactive intercalator on graphite electrode.Anal Chim Acta,1996,335:239
14，Millan K M,Saraullo A,Mikkelsen S R.Voltammetric DNA biosensor for cystic fibrosis based on a modified carbon paste electrode.Anal Chem,1994,66:2943
15，Carter M T,Rodriguez M,Bard A J,Voltammetric studies of interaction of metal chelates with DNA.2.Tris-chelated complexes of coblt (Ⅲ) and iron(Ⅱ) with 1,10-phenanthroline and 2,2-bipyridine.J Am Chem Soc,1989,111,8901
16，Carter M T,Bard A J.Voltammetric studies of the interaction of tris (1,10-phenanthroline)cobalt (Ⅲ) with DNA.J Am Chem Soc,1987,109,7528
17，Rodriguez M,Bard A J.Eletrochemical studies of the interaction of metal chelates with DNA.4.Voltammetric and Electrogenerated Chemiluminescent Studies of the interaction of tris(2,2-bipyridine)osmium(Ⅱ) with DNA.Anal Chem,1990,62:2658
18，Bard A J.New challenges in electrochemistry and electroanalysis.Pure Appl Chem,1992,64:185
19，孙星炎，徐春，刘盛辉等.DNA 电化学传感器在DNA损伤研究中的应用.高等学校化学学报，1998，19(9)：1393
20，Wang J,Ozsoz M,Cai X-H,et al.Interactions of antitumor drug daunomycin with DNA in solution and at the surface.Bioelectrochem and Bioenerg,1998,45:33
21，Chu X,Shen G-L,Jiang J-H,et al.Voltammetric studies of the interaction of daunomycin anticancer drug with DNA and analytical applications.Anal Chim Acta,1998,373:29
22，方禹之，刘盛辉，何品刚.用盐酸阿霉素作为嵌入剂石墨电极伏安法识别测定DNA片段的研究.高等学校化学学报，1996，17(8)：1222
23，庞代文，齐义鹏，杜全胜等.DNA与水溶性卟啉H2TMAP的相互作用.科学通报，1994，39(17)：1606
24，刘盛辉，何品刚，方禹之.在石墨电极上脱氧核糖核酸与米托蒽醌嵌入作用的电化学研究.分析化学，1996，24(11)：1301
25，Wang J,Palecek E,Nielsen P E,et al.Peptide nucleic acid probes for sequence-Specific DNA biosensors.J Am Chem Soc,1996,118:7667
26，Fawcett N C,Evans J A,Chien L-C,et al.Nucleic acid hybridization detected by piezoelectric resonance.Anal Lett,1988,21(7):1099
27，Okahata Y,Matsunobu Y,Ijiro K,et al.Hybridization of nucleic acids immobilized on a quartz crystal microbalance.J Am Chem Soc,1992,114:8299
28，Yamaguchi S,Shimonura T,Tatsuma T,et al.Adsorption,immobilization,and hybridization of DNA studied by the use of quartz crystal oscillators.Anal Chem,1993,65:1925