超临界CO2流体萃取苦豆子中氧化苦参碱及其含量测定

摘要：采用超临界C02，流体萃取法提取苦豆子中的氧化苦参碱，以0.1ml／L氨水作碱化剂，在45℃压力，42MPa的条件下萃取l。并用高效液相色谱法对萃取液中的氧化苦参碱进行定量分析，结果表明该方法可靠，精密度高，同时也为其他生物碱利用超临界C02流体萃取法的萃取及定量建立了一种快速、简便、有效的方法。
关键词：超临界Co2流体萃取法 苦豆子 氧化苦参碱 高效液相色谱法

    苦豆子为豆科槐属植物，药用根、茎、全草及种子，具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫等功能。其有效成分生物碱含量较高，主要为：苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱和苦豆碱等20余种。大多数单碱对多种类生物(如真菌、细菌、线虫、昆虫、哺乳动物包括人类)有多方面的生物活性。尤其近年来发现的抗癌而又增强免疫力等独特的药理作用为医药界所瞩目。
    在超临界CO2流体萃取(CO2-SFE)中，由于处于超临界状态下的CO2流体兼顾了液体及气体的传质特点，且超临界CO2流体萃取的特性和极性还可以通过调节萃取压力、温度、加入不同品种的夹带剂等因素方便的调节，从而使超临界CO2流体萃取显示了快速、提取效率高、选择性好等特点。中药中的生物碱等极性偏大，加大压力后，CO2流体的密度和解电常数增大，极性增强：加入夹带剂也可有效地增大流体的溶解性能，促进成分的溶出。
    本实验用76％的乙醇作为夹带剂对苦豆子中的氧化苦参碱进行提取。并用高效液相色谱法， 以YWG-NH2为固定相，乙腈-无水乙醇-磷酸水溶液为流动相，测定氧化苦参碱的含量，现将实验结果报告如下：

1 仪器和试剂：FY221-50-60型超临界萃取装置(南通市飞宇石油科技开发有限公司)，美国WATERS高效液相色谱仪，600高压双泵，2996二极管阵列检测器，7725i定量进样阀，Millennium 系统软件。氧化苦参碱对照品由中国药品生物制品检定所提供，生药材由天津市药检所提供并检定乙腈为HPLC级，水为超纯水，二氧化碳(99．99％)由兴平化工厂提供，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果
2．1 色谱条件：色谱柱：YWG-NH2，250mm×4．6mm，l0μm，流动相：乙腈-无水乙醇-水(80：
10：10，磷酸调PH=2)，流速：1．0Ml/min，检测波长：220nm，用外标法检测。
2．2 超临界CO2流体萃取的条件
2．2．1 碱化试剂的选择：生物碱在植物中多数以盐的形式存在，若直接用极性较弱的溶剂提取，往往提取不完全，所以在提取前需先碱化，使之全部转化为游离碱，碱化剂可采用Ca(OH)2、三乙胺或氨水，由于Ca(OH)2不易溶于水，且易产生杂质，而三乙胺对萃取槽的腐蚀性也较大，故本实验采用氨水作为碱化剂，以投料量的二倍量浸泡过夜。
2．2．2 萃取压力的选择：物质处于其临界温度fc)，临界压力(Pc)以上时，成为单一相态，称
为超临界流体。所以考察压力对提取率的影响，必须选择临界压力以上的压力。在超临界流体中，压力越大，则流体的密度越大，萃取的能力越强，但对于杂质的萃取量也随之增加。CO2的临界压力为7．534MPa。而在提取生物碱时，35MPa和42MPa样品的提取率间有非常显著的差异，而42MPa与49MPa间样品提取率则无显著差异，但随提取压力的增加，杂质的提取率也有增加，所以选择42MPa为本实验的萃取压力。
2．3 氧化苦参碱的提取：苦豆子粉末投料300g，加0．1ml／L氨水600ml浸泡过夜，次Et投入萃取釜中，于45oC、CO2流量0．70Nm3／h连续萃取。萃取过程中分3次加入夹带剂约200ml，1．5h后第一次收集萃取液，以后每隔0．5h收集一次，直到无萃取液产生。整个萃取过程约为2h，收集萃取液约100ml，其上层为浅黄至棕黄色透明液体，底部有少许棕黄色沉淀。
2．4 萃取液中苦参碱及氧化苦参碱的总含量测定
2．4．1 线性范围：贮备液制备：精密称取氧化苦参碱对照品2mg，置25mL量瓶中，用无水乙醇溶解，稀释至刻度，摇匀备用。线性范围：精密量取上述贮备液0．25，0．50，1．50，2．50，3．50，4．50mL， 置10mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，按上述色谱条件进样10 ，记
录峰面积，以对照液浓度(C)与其相应峰面积(A)求得氧化苦参碱的回归方程分别为：A=277762．0C一10870．0， r=0．9994
线性范围为0．4-o．5p．g・mL-
2．4．2 精密度实验：取线性方程中1、2、4号对照品，分别进样5 ，测定其峰面积，计算RSD(n=
5)分别为0．9、1．1、1．7％。
2．4．3 加样回收率：精密量取6份萃取液lml，分别加入储备液0．5、1．0、1．5ml，置于10rnl量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，以滤膜过滤，分别进样5乩测量峰面积，计算加样回收率平均为98．72％，RSD=3．2％ (n=6)。
2．4．4 样品测定：精密量取萃取液lml，转移至10ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，以滤膜过滤，即得供试液，平行制样5份。取上述溶液各5μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以外标法计算氧化苦参碱含量。样品色谱图及对照品色谱图见图1、2。结果表明5份样品的氧化苦参碱含量平均值为：4．82％ 。RSD=2．13％ 。
2．4．5 稳定性实验：取线性方程中1、3、5号对照品，分别间隔1h进样5 ，测定峰面积，计算变异系数RSD (n=5)为1．7％。隔Et再取上述样品进样，计算日间变异系数RSD(n=5)为1．2％。上述结果表明，氧化苦参碱其日内日间均表现良好稳定性。

3 讨论
3．1 在夹带剂的选择中，常用的有乙醇、甲醇、苯等有机溶剂，考虑到生物碱易溶于有机溶剂，以及乙醇对仪器的腐蚀性最小，因此实验前拟定乙醇为夹带剂。并根据参考文献[4]选取了四种浓度的乙醇溶液(95、80、76、700%)作为夹带剂分别进行实验性验证，验证结果表明，以76％浓度的乙醇作为夹带剂的提取率均高于以其他三种浓度的乙醇作夹带剂时的提取率，与文献较吻合。
3．2 苦豆子中的生物碱主要有苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱和苦豆碱等20余种，其中苦参总碱占到全部生物碱的6～8％。且在苦豆子的冷浸出液中，以氧化苦参碱为主，而加热或煎煮可能使氧化型碱转化为相应的非氧化型碱。由于在超临界CO2流体萃取中，提取温度不高，温度变化范围小，且提取条件稳定，因此对于提取率标识物的确定，选择了氧化苦参碱。
3-3 在本实验中，对于苦豆子中氧化苦参碱的提取时间为2h，消耗有机溶剂为200ml，氧化苦参碱提取率为4～5％，其各项数值均优于传统的回流萃取法，充分显示了超临界CO2流体萃取的先进性。但本文仅对超临界CO2流体萃取的重要因素如夹带剂、萃取温度、萃取压力进行了考察。而影响超临界CO2流体萃取的因素还有很多，如分离压力、CO2的流量及夹带剂的流量等。且超临界CO2流体萃取的条件决定了它特别适合于提取脂溶性成分，而利用超临界CO2流体萃取生物碱的应用并不广泛，各种条件尚在摸索之中，因此，利川超临界CO2流体萃取法提取各种生物碱尚待更深入的研究。

参考文献
[1]仲仁山，苦豆子的研究及其应用[M]，银川，宁夏人民山版社。1983
[2]高得霖，化工进展。1985(3)：24
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[4]姜继祖，等。中草药，1997，28(3)：147
[5]张华，等，药物分析杂志，2000，20(6)：408
[6]原永芳，等，药学学报，1996，31(4)：282