离子色谱线性梯度淋洗分离阴离子的计算机模拟

　　摘要  建立了使用氢氧化钠淋洗液时用计算机模拟离子色谱梯度淋洗分离阴离子的新方法，研究了在线性梯度淋洗过程中不同时间阴离子在色谱柱中的位置及所在位置的淋洗液浓度，得出阴离子在不同时间的容量因子、迁移速度，通过积分得到保留时间。再根据离子色谱峰峰形变化的规律，得到色谱峰峰形的参数。模拟色谱图保留值与实验值的相对误差小于5%，模拟色谱图的色谱峰峰形与实验所得到的色谱图的色谱峰峰形也非常接近。

　　关键词  离子色谱，梯度淋洗，保留模型，阴离子，色谱峰峰形

　　1  引言

　　用离子色谱法适合于分析无机、有机阴离子。梯度淋洗是快速、灵敏分析强保留离子和弱保留离子混合物的有效方法。但梯度淋洗的条件的摸索却相当费时，如果能创建计算机模拟程序，先根据样品的组成，对要分析的样品进行模拟分离，得出大致条件，再通过实验进行适当校正，能大大提高工作效率。实现离子色谱线性梯度条件下分离阴离子的计算机模拟的关键是梯度条件下阴离子保留值的预测和离子色谱峰峰形的预测。Madden等［１］研究了用人工神经网络（artificial neural network）对离子色谱线性梯度条件下分离阴离子的保留值的预测。该方法用一系列不同的梯度淋洗的实验数据对神经网络进行训练，从而使此系统有预测智能。国外一些学者在经典离子交换色谱梯度淋洗分离蛋白质保留值的预测方面进行了很多工作[2～４]。国内尚未见在梯度条件下阴离子保留值的预测和离子色谱模拟分离方面工作的报道。人们在反相液相色谱梯度条件下组分保留值的预测方面也做了大量的工作[５～７]。

　　本实验使用Dionex AS18阴离子分离拄，用ＮaOH淋洗液，研究了在梯度淋洗过程中不同时间组分质点在离子色谱柱中的位置，及所在时间和位置的淋洗液浓度，得出所在时间和位置的容量因子，从而得出组分所在时间和位置的迁移速度，通过积分得出保留时间。再根据离子色谱峰峰形变化的规律，得到色谱峰峰形的有关参数，编程进行模拟分离，得到了保留时间与峰形与实验非常接近的色谱图。

　　2  理论

　　2.1  等度淋洗保留模型

　　梯度淋洗保留值的数学模型是建立在等度淋洗的数学模型基础上的。使用NaOH作为淋洗液时，常用实验节点模型（EEPM）[８] 预测保留值，阴离子容量因子k和ＮaOH浓度关系如下：lgk=C1+C2lg［OH－］（1）    通过实验数据可以求出待定系数C1 和C2。

　　还有一个模型称为DryLab模型[９]，此模型在EEPM基础上加了一个二次项校正：lgk=C1+C2lg［ＯＨ－］＋Ｃ３（lg［ＯＨ］）２（2）    Madden等[９]的研究证明，用DryLab模型对一些极弱有机酸阴离子和磷酸根等离子的误差更小。

　　由于EEPM模型预测较简单又较准确，对于大多数阴离子，则采用EEPM模型预测；对于磷酸根、砷酸根等阴离子，则采用DryLab模型。

　　2.2  梯度淋洗的保留值的数学模型

　　２．２．１  初始等度运行阶段  梯度程序开始有时有一段等度运行时间t0，此时整个色谱柱，淋洗液的浓度均为初始浓度。如果用EEPM模型，此时组分质点的迁移速度为：v=v0     k0+1=v0     exp(C1+C2lg［ＯＨ－］0）＋１（３）    其中v为组分质点的迁移速度，v0为淋洗液质点的迁移速度，[OH－]0为淋洗液的初始浓度。

　　２．２．２  淋洗液的浓度开始增加到停止增加阶段  等度运行时间t0过后，淋洗液浓度开始升高。对于低压梯度色谱系统，淋洗液浓度的升高是从比例阀开始的，经过压力传感器、泵头、梯度混合器及管路到进样环、到色谱柱头，需要一段时间，这段时间称之为仪器滞后时间[5,6]。该滞后时间对等度淋洗不会产生丝毫影响，但使得梯度淋洗液的浓度变化延时。初始时间后到初始时间加仪器滞后时间范围内，虽然比例阀处淋洗液浓度已在升高，但整个色谱柱内，淋洗液的浓度仍为初始浓度，此时组分质点的迁移速度仍为（3）式。初始等度运行时间加仪器滞后时间，在色谱柱柱头，淋洗液的浓度开始上升。但由于前一段时间的等度淋洗，组分质点已迁移了一段距离，在组分质点处，在浓度开始增加的淋洗液质点追上组分质点前，淋洗液的浓度仍为初始浓度，此时组分质点的迁移速度仍为（3）式。

　　再经过一段时间，浓度开始增加的淋洗液质点追上组分质点，从此时到淋洗液浓度停止增加，组分质点位置的淋洗液的浓度为：［ＯＨ－］＝［ＯＨ－］０＋（t-td-t0-t1）S(4)其中t为从进样到此时的时间，td为仪器滞后时间，t0为初始等度运行时间，t1为淋洗液质点从柱头到追上组分质点所需要的时间。s为单位时间淋洗液浓度的增加值。此时组分质点的迁移速度为：v=v0[]k0+1=v0     exp｛Ｃ１＋Ｃ２lg［［ＯＨ－］０＋（t-td-t0-t1）S］｝＋１(5)２．２．3  淋洗液的浓度上升停止阶段  淋洗液浓度停止增加后的开始阶段，浓度停止增加的淋洗液质点还没有追上组分质点。在组分质点位置处，淋洗液浓度还在继续增加，组分质点位置的淋洗液的浓度仍然为(4) 式，此时组分质点的迁移速度仍然为(5)式。

　　一段时间后，浓度停止增加的淋洗液质点追上组分质点，则组分质点位置的淋洗液的浓度为此阶梯度的淋洗液最终浓度。此时组分质点的迁移速度为：v=v0     k+１=v0     C1+C2lg［ＯＨ－］f＋１（６）    [OH-] f为此阶梯度的淋洗液最终浓度。则一阶离子色谱线性梯度条件下组分离子保留时间为：tR=l1     vi＋∫l2     0dl     v＋l３     vf=l1＋l3     v0/［exp(C1+C2lg［ＯＨ－］０)］＋１＋∫l2     0dl     v0／［exp(C1+C2lg［ＯＨ－］０)］(7)    其中vi为初始等度淋洗阶段组分离子的迁移速度，l1为在此迁移速度下组分的迁移的距离，l2为在梯度淋洗条件下组分变速迁移的距离，vf为淋洗液的浓度为最终浓度阶段组分离子的迁移速度，l3为在此迁移速度下迁移的距离。需要注意的是，这里梯度淋洗阶段和最终浓度阶段，是针对组分所处的位置的淋洗液的浓度而言，滞后于梯度程序的梯度淋洗阶段和最终浓度阶段。

　　3  实验部分

　　3.1  仪器和试剂

　　美国Dionex 2500 IC离子色谱仪系统，配有GP50梯度泵、LC250柱温箱、脱气装置、ED50电导检测器、ASRS ULTRA II (2mm)电导抑制器、戴尔P4电脑配Chromeleon色谱工作站及Borland Delphi 7.0程序设计语言。实验所用的甲酸、NaCl,NaNO3等试剂均为分析纯试剂。

　　3.2  色谱柱和流动相

　　以浓度为50%的NaOH溶液（美国Fair Lawn公司）配制淋洗液。用去离子水将分析纯试剂甲酸、氯化钠，亚硝酸钠、硫酸钠、硝酸钠、磷酸钠、碘化钾、柠檬酸三钠配制成浓度为200 mg/L的储备液，使用前将其稀释成浓度为2~10 mg/L的溶液。所用水为去离子水，其电阻率大于10 MΩ?cm 。

　　Ion PacAG18阴离子保护柱（50 mm×2mm i.d.），Ion PacAS18阴离子分离柱（250 mm×2 mm i.d.）。柱温：30℃。以NaOH溶液作为淋洗液，由去离子水和NaOH溶液组二元梯度淋洗系统。A为去离子水；B浓度为100 mmol/L的NaOH溶液。淋洗液流速：0.25 mL/min。

　　3.3  仪器滞后时间td和死时间tM的测定

　　将离子色谱保护柱柱头的淋洗液管路断开，开泵用100%的去离子水的冲洗。将压力传感器、泵头、梯度混合器及管路到进样环里面的ＮaOH冲洗干净后(通过测流出液的pH值)，开始输送NaOH溶液，流速为0.25 mL/min。从这时起到进样环流出液为碱性，这段时间即为仪器滞后时间td。在此色谱条件下，测得td=3.75 min。以去离子水的负峰的出峰时间作为死时间，测得tM=2.95 min。

　　4  结果与讨论

　　4.1  不同阴离子容量因子的对数与淋洗液浓度的对数的关系

　　对于所研究的每一种阴离子，通过测得的7~10个不同淋洗液浓度条件下的保留时间，算出在不同淋洗液浓度条件下的容量因子。通过一元线性回归（用EEPM模型）或二次多项式回归（用DryLab模型）处理，得到不同阴离子容量因子的对数与淋洗液浓度的对数的关系的回归方程（见表1）。将不同阴离子的回归方程的C1 、C2和C3存入数据库，模拟时调用。对于绝大多数阴离子，用EEPM模型就能准确地描叙阴离子容量因子的对数与淋洗液浓度的对数的关系。但对于磷酸根这样的末级电离常数非常小的阴离子，用DryLab模型较好[８]。

　　4.2  计算机模拟程序

　　设计一Delphi程序，模拟用NaOH淋洗液梯度淋洗分离不同的阴离子。程序运行后，选择梯度淋洗的色谱条件，选择模拟分离的阴离子及浓度。模拟进样后，程序根据选择的数据，从数据库中调出不同的阴离子的容量因子随淋洗液浓度变化关系数据，运用前面所述的数学模型，算出各时刻阴离子质点所在位置的淋洗液浓度、对应的容量因子、迁移速度、保留时间。色谱图用修改的高斯曲线模型EMG曲线模型[９，１０] 模拟。通过实验、数据处理后得到不同的阴离子在等度淋洗及梯度淋洗条件下的EMG参数随保留值变化的速率，存入数据库，模拟时调用。梯度淋洗时EMG参数σ、τ随保留值增加的速率较慢，从而模拟得到较窄的色谱峰。基线漂移的模拟是根据实际每分钟漂移的信号的大小，将漂移值叠加到修改的高斯曲线中。基线的噪音通过将随机函数值叠加到修改的高斯曲线进行模拟。

　　表1  8种阴离子容量因子的对数与淋洗液浓度的对数的关系的回归方程和相关系数（略）

　　Table 1  Regression equations and correlation coefficients of 8 anions of lgarithms of retention factors and lgarithms of concentrations of sodium hydroxide

　　4.3  模拟结果及讨论

　　图1A和图1B分别为２种不同的梯度程序淋洗甲酸根、Cl、ＮＯ－２、ＳＯ２－４、ＮＯ－３、ＰＯ３－４、柠檬酸根和Ｉ－的色谱图和模拟色谱图。表2为这些阴离子在这２种梯度淋洗条件下保留值的预测值误差的统计数据。梯度淋洗程序1为比较平缓的线性梯度，条件为：开始时淋洗液浓度从32 mmol/L线性上升，15 min后升高到80 mmol/L，保持5 min后回到初始浓度。梯度淋洗程序2为比较陡峭的线性梯度，条件为：开始有4 min的淋洗液浓度为28 mmol/L的等度淋洗，4 min后淋洗液浓度开始线性上升，上升1 min后升高到100 mmol/L，保持15 min后回到初始浓度，此梯度接近于一台阶梯度。

　　图1中甲酸根、Ｃl-和NO-2实际是等度淋洗出色谱柱的。因为仪器在此条件下有3.75 min的滞后时间，浓度升高的淋洗液还没有到达色谱柱头，甲酸根已流出色谱柱。虽然Ｃl-和NO-2的保留时间大于仪器的滞后时间，但浓度升高的淋洗液到达色谱柱头时，Ｃl-和NO-2已快流出色谱柱，浓度升高的淋洗液还未追上Cl-，Cl-和NO-2已流出色谱柱。同理，由于有4 min的等度淋洗，图1B中除了甲酸根、Cl-、NO-2外，SO2-4也是等度淋洗出色谱柱的。

　　图1  8种阴离子的色谱图(a)和模拟色谱图(b)（略）

　　Fig.1  Chromatogram (a) and simulating chromatogram (b) of 8 anions

　　A. 程序1��平缓线性梯度(gradient elution profile 1: mild linear gradient); B. 程序2��陡峭线性梯度(gradient elution profile 2: steep linear gradient)。1. HCOO-; 2. Cl-; 3. NO-2; 4. SO2-4; 5. NO-3; 6. PO3-4; 7. 柠檬酸根(citrate); 8. I-。

　　从表2可以看出，此程序模拟离子色谱梯度淋洗阴离子，无论是比较平缓的线性梯度还是接近于台阶梯度的线性梯度，模拟色谱图的保留时间是比较准确的，最大相对误差小于5%。

　　表2  梯度淋洗条件下8种阴离子实验色谱图的保留时间与模拟色谱图保留时间的比较（略）

　　Table 2  Comparison retention times of experimental chromatogram and emulate chromatogram for 8 anions in gradient elution

　　离子色谱梯度淋洗阴离子色谱峰峰形的变化规律比较复杂。对于比较平缓的线性梯度（如图1A）。变化规律比较简单，基本上符合色谱峰的EMG参数σ（标准偏差）、τ （指数衰减时间常数）随保留时间线性变化的规律[11]，图1A(b）就是基于这种数学模型模拟的结果。与图1A（a）进行比较，色谱峰峰形非常接近。对于台阶梯度和比较陡的线性梯度，色谱峰峰形的变化规律相当复杂，台阶梯度和比较陡的线性梯度的色谱图一般有一个陡坡，一般来说，在靠近陡坡顶出峰的色谱峰，色谱峰比较窄。在有些情况下，色谱峰特别窄（如图1B），保留时间较长的柠檬酸根的色谱峰还大大窄于保留时间较短的ＳＯ２４、ＮＯ－２的色谱峰。用此峰来计算色谱柱柱效，柱效离奇的高（色谱工作站显示用柠檬酸根的色谱峰计算色谱柱柱效高达36401理论塔板数，其半蜂宽大大低于保留时间较短的ＳＯ２－４、ＮＯ－２、ＰＯ３－４的保留时间）。有关机理非常复杂，Enlund等［１２］对色谱和毛细管电泳出现的柱效奇高的现象进行了探讨。本研究模拟时，也考虑了这一点。图1B（b）为在图1B（a）条件下的模拟色谱图，模拟色谱图与真实色谱图的峰形非常接近。

　　致谢  感谢武汉大学冯钰教授的指导。

　　参考文献

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　　1０  Lu Peizhang(卢佩章)，Zhang Yukui(张玉奎), Liang Xinmiao(梁鑫淼). High Performance Liquid Chromatography and It′ s Expert System(高效液相色谱法及其专家系统), Shenyang: Liaoning Science and Technology Press, 1992: 128~130

　　1１  Enlund A M, Andersson M E, Hagman G. J. Chromatogr. A, 2004, 1004: 153~158

　　本文系湖北省自然科学基金资助项目（No.2003ABA091）

　　（江汉大学化学与环境工程学院,武汉 430056）