HPLC基础知识培训教程(七)
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5)、池体积:除制备色谱外,大多数HPLC检测器的池体积都小于10µ;l。在使用细管径柱时,池体积应减少到1~2µ;l甚至更低,不然检测系统带来的峰扩张问题就会很严重。而且这时池体、检测器与色谱柱的连接、接头等都要精心设计,否则会严重影响柱效和灵敏度。
3.紫外检测器(ultravioletdetector)
UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器,当检测波长范围包括可见光时,又称为紫外-可见检测器。它灵敏度高,噪音低,线性范围宽,对流速和温度均不敏感,可于制备色谱。由于灵敏高,因此既使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用UV检测器进行微量分析。但要注意流动相中各种溶剂的紫外吸收截止波长。如果溶剂中含有吸光杂质,则会提高背景噪音,降低灵敏度(实际是提高检测限)。此外,梯度洗脱时,还会产生漂移。
注:将溶剂装入1cm的比色皿,以空气为参比,逐渐降低入射波长,溶剂的吸光度A=1时的波长称为溶剂的截止波长。也称极限波长。
中国药典对UV法溶剂的要求是:以空气为空白,溶剂和吸收池的吸收度在220~240nm范围内不得超过0.40,在241~250nm范围内不得过0.20,在251~300nm范围内不得过0.10,在300nm以上不得过0.05。
V检测器的工作原理是Lambert-Beer定律,即当一束单色光透过流动池时,若流动相不吸收光,则吸收度A与吸光组分的浓度C和流动池的光径长度L成正比:
A=lg=lg=ECL
式中I0为入射光强度,I为透射光强度,T为透光率,E为吸收系数。
UV检测器分为固定波长检测器、可变波长检测器和光电二极管阵列检测器(photodiodearraydetector,PDAD)。按光路系统来分,UV检测器可分为单光路和双光路两种。可变波长检测器又可分单波长(单通道)检测器和双波长(双通道)检测器。PDAD是80年代出现的一种光学多通道检测器,它可以对每个洗脱组分进行光谱扫描,经计算机处理后,得到光谱和色谱结合的三维图谱。其中吸收光谱用于定性(确证是否是单一纯物质),色谱用于定量。常用于复杂样品(如生物样品、中草药)的定性定量分析。
4.与检测器有关的故障及其排除
1)、流动池内有气泡
如果有气泡连续不断地通过流动池,将使噪音增大,如果气泡较大,则会在基线上出现许多线状“峰”,这是由于系统内有气泡,需要对流动相进行充分的除气,检查整个色谱系统是否漏气,再加大流量驱除系统内的气泡。如果气泡停留在流动池内,也可能使噪音增大,可采用突然增大流量的办法除去气泡(最好不连接色谱柱);或者启动输液泵的同时,用手指紧压流动池出口,使池内增压,然后放开。可反复操作数次,但要注意不使压力增加太多,以免流动池破裂。
2)、流动池被污染
无论参比池或样品池被污染,都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池,要注意溶剂的互溶性;如果污染严重,就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗,或者取出池体进行清洗、更换窗口。
3)、光源灯出现故障
紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时,可能产生严重噪音,基线漂移,出现平头峰等异常峰,甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯。
4)、倒峰
倒峰的出现可能是检测器的极性接反了,改正后即可变成正峰。用示差折光检测器时,如果组分的折光指数低于流动相的折光指数,也会出现倒峰,这就需要选择合适的流动相。如果流动相中含有紫外吸收的杂质,使用紫外检测器时,无吸收的组分就会产生倒峰,因此必须用高纯度的溶剂作流动相。在死时间附近的尖锐峰往往是由于进样时的压力变化,或者由于样品溶剂与流动相不同所引起的。
五、数据处理和计算机控制系统
早期的HPLC仪器是用记录仪记录检测信号,再手工测量计算。其后,使用积分仪计算并打印出峰高、峰面积和保留时间等参数。80年代后,计算机技术的广泛应用使HPLC操作更加快速、简便、准确、精密和自动化,现在已可在互联网上远程处理数据。计算机的用途包括三个方面:①采集、处理和分析数据;②控制仪器;③色谱系统优化和专家系统。
六、恒温装置
在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温度,柱子的恒温精度要求在±0.1~0.5℃之间,检测器的恒温要求则更高。
温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。一般来说,温度升高,可提高溶质在流动相中的溶解度,从而降低其分配系数K,但对分离选择性影响不大;还可使流动相的粘度降低,从而改善传质过程并降低柱压。但温度太高易使流动相产生气泡。
色谱柱的不同工作温度对保留时间、相对保留时间都有影响。在凝胶色谱中使用软填料时温度会引起填料结构的变化,对分离有影响;但如使用硬质填料则影响不大。
总的说来,在液固吸附色谱法和化学键合相色谱法中,温度对分离的影响并不显著,通常实验在室温下进行操作。在液固色谱中有时将极性物质(如缓冲剂)加入流动相中以调节其分配系数,这时温度对保留值的影响很大。
不同的检测器对温度的敏感度不一样。紫外检测器一般在温度波动超过±0.5℃时,就会造成基线漂移起伏。示差折光检测器的灵敏度和最小检出量常取决于温度控制精度,因此需控制在±0.001℃左右,微吸附热检测器也要求在±0.001℃以内。
IV.固定相和流动相
在色谱分析中,如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离,是色谱工作者的重要工作,也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。本章着重讨论填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质(担体)
HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质,也可以是有机聚合物基质。无机物基质主要是硅胶和氧化铝。无机物基质刚性大,在溶剂中不容易膨胀。有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有机聚合物基质刚性小、易压缩,溶剂或溶质容易渗入有机基质中,导致填料颗粒膨胀,结果减少传质,最终使柱效降低。
1.基质的种类
1)、硅胶
硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。除具有高强度外,还提供一个表面,可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基,制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。通常,硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。
硅胶的主要性能参数有:
①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布。与比表面积成反比。
③比表面积。在液固吸附色谱法中,硅胶的比表面积越大,溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度(率)。在反相色谱法中,含碳量越大,溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色谱法中,硅胶的含水量越小,其表面硅醇基的活性越强,对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色谱法中,主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状。硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶,前者价格较便宜,缺点是涡流扩散项及柱渗透性差;后者无此缺点。
⑧硅胶纯度。对称柱填料使用高纯度硅胶,柱效高,寿命长,碱性成份不拖尾。
2)、氧化铝
具有与硅胶相同的良好物理性质,也能耐较大的pH范围。它也是刚性的,不会在溶剂中收缩或膨胀。但与硅胶不同的是,氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相,并显示出优秀的pH稳定性。
3)、聚合物
以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC,它们的压力限度比无机填料低。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强。使用任何流动相,在整个pH范围内稳定,可以用NaOH或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本质上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强,但它可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙烯-二乙烯苯那样耐酸碱,但也可以承受在pH13下反复冲洗。
所有聚合物基质在流动相发生变化时都会出现膨胀或收缩。用于HPLC的高交联度聚合物填料,其膨胀和收缩要有限制。溶剂或小分子容易渗入聚合物基质中,因为小分子在聚合物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢,所以造成小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像蛋白质或合成的高聚物,聚合物基质的效能比得上陶瓷性基质。因此,聚合物基质广泛用于分离大分子物质。
2.基质的选择
硅胶基质的填料被用于大部分的HPLC分析,尤其是小分子量的被分析物,聚合物填料用于大分子量的被分析物质,主要用来制成分子排阻和离子交换柱。