酶联免疫吸附试验中的相关因素与结果分析
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<font> 1抗体的酶标记方法及标记效果测定<br /> 1.1标记方法：良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。<br /> 酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5(g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。<br /> 1.2酶标抗体标记效果测定：测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。<br /> 1.2.1酶与抗体的活性 常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在显色后，琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。<br /> 1.2.2结合物的定量测定 一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定，然后按下列公式计算：<br /> 酶量（mg/ml）＝OD403×0.42<br /> IgG量（mg/ml）＝（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62<br /> 对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算： </font>
<font> IgG量（mg/ml）＝（OD280－OD403×0.34）×0.62<br /> 已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔（mol）比值。<br /> HRP/IgG摩尔比值＝HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4<br /> 结合物中酶总量＝HRP（mg/ml）×结合物溶液量<br /> 结合物产率＝结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100％<br /> 用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达 1000(g/ml时效果最好。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般，1.0时效果较好，1.5-2.0时最好。酶结合率为 7％时效果一般，为9％－10％较好，达30％以上时最好。<br /> </font>
<font> 作者：李剑华作者单位：154600黑龙江省大庆油田总医院 </font>
<font> 酶联<a target="_blank"><u>免疫</u></a>吸附试验（enzyme-linked immunoadsordent assay;ELISA） 是<a target="_blank"><u>医学检验</u></a>的<a target="_blank"><u>免疫</u></a>学检验方法之一，已经广泛应用到对病原<a target="_blank"><u>微生物</u></a>的<a target="_blank"><u>免疫学</u></a>检查试验中。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。用ELISA法检测<a target="_blank"><u>乙肝</u></a>病毒感染者的血清标志物（两对半）是目前最常用的<a target="_blank"><u>实验室</u></a>检验方法。和任何<a target="_blank"><u>实验室</u></a>检查方法一样，ELISA存在少量的假性结果（假阳性、假阴性），对临床诊断和治疗会有一定的影响。由于ELISA反应所测对象可以是抗原也可以是抗体，显色反应对结果的阴性和阳性也有两种不同的判断，所以这里以显色为阳性的模式为例归纳其影响因素如下。 </font>
<font> 1抗体的酶标记方法及标记效果测定<br /> 1.1标记方法：良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。<br /> 酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5(g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。<br /> 1.2酶标抗体标记效果测定：测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。<br /> 1.2.1酶与抗体的活性 常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在显色后，琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。<br /> 1.2.2结合物的定量测定 一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定，然后按下列公式计算：<br /> 酶量（mg/ml）＝OD403×0.42<br /> IgG量（mg/ml）＝（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62<br /> 对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算： </font>
<font> IgG量（mg/ml）＝（OD280－OD403×0.34）×0.62<br /> 已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔（mol）比值。<br /> HRP/IgG摩尔比值＝HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4<br /> 结合物中酶总量＝HRP（mg/ml）×结合物溶液量<br /> 结合物产率＝结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100％<br /> 用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达 1000(g/ml时效果最好。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般，1.0时效果较好，1.5-2.0时最好。酶结合率为 7％时效果一般，为9％－10％较好，达30％以上时最好。<br /> </font>
