感染性疾病基因诊断进展

　　感染性疾病有病原微生物引起，致病的病原微生物主要有病毒、细菌、衣原体、支原体和螺旋体等。这些病原体的传统检测方法通常采用形态学检查，体外培养和免疫学试验。但对某些难以培养的病原体，抗原抗体检测不能判断体内病原体 DNA 或 RNAde 复制情况，或存在检测灵敏度低等问题。自聚合酶链反应（ PCR ）技术问世以来，基因诊断技术作为病原体检测的新方法得到突飞猛进的发展。

一、病原体基因诊断的主要技术方法

1 、实时荧光定量 PCR （ Real Time Flourescence quantitative PCR, FQ—PCR ）

　　聚合酶链反应（ PCR ）技术虽已被广泛应用于核酸分析，但普通 PCRhai 存在一些不足：

（ 1 ）只有定性结果，无法给出临床需要的定量结果；

（ 2 ）由于采用电泳检测，易引起 PCR 产物的交叉污染，增加了假阳性结果的可能性；

（ 3 ）采用的染色剂溴乙锭是致癌物，可能危害操作人员及污染环境。

　　为了解决上述问题，建立了定时荧光定量 PCR 方法（ Real Time Flourescence quantitative PCR,FQ—PCR ） , 其中应用最广泛的是 TaqMan 法。该技术在常规 PCR 基础上，添加了一条标记 2 个荧光基团的荧光双标记探针。一个标记在探针的 5' 端，称为荧光报告基团（ R ）；另一个标记在探针的 3' 端，称为荧光抑制基团（ Q ）。探针的 3' 羟基（ -OH ）已被去除或封闭，不具有延伸能力。在探针分子完整的情况下， R 发出的荧光被 Q 淬灭吸收。此时检测不到荧光信号。当特异性 PCR 扩增发生时，探针会在 PCR 过程中被 Taq 酶的 5'--3' 活性作用切断（切口平移效应），抑制作用消失，从而引起报告基团荧光信号的产生。荧光信号伴随 PCR 产物的增长而增长。实时荧光定量 PCR 方法就是利用此原理，在 PCR 过程中，连续不断的检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到某一阈值（根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，计算出以 99.7% 的置信度大于平均值的荧光值，即为阈值）时，此时的循环次数（ Ct 值）就被记录下来，该循环参数和 PCR 体系中起始 DNA 量的对数值之间有严格的线性关系，利用阳性梯度标准品的 Ct 值，制成标准曲线，再根据样品的 Ct 值就可以准确定出起始 DNA 的数量。目前用于临床检测的病原体基因诊断试剂绝大部分是此类。

　　基因芯片或微阵列是近年发展起来的分子生物学研究工具。在 1 平方厘米的芯片上可以同时分析几百至数万个基因，具有高通量、快速获取有关生物学信息的特点。基因芯片技术事实上是一个小型的反向点杂交系统，将几百至数十万个 cDNA 或寡核苷酸密集排列与固相支持物上，作为探针。把要研究的样品 DNA （称靶 DAN ）用荧光标记后与芯片上的探针进行杂交，透过扫描后，对杂交结果进行计算机软件分析，根据杂交信号的强弱和序列即可确定靶 DNA 的表达情况以及突变和多态性的存在。基因芯片的优势在于可以一次检测多种病原微生物，不仅可进行病原微生物种、亚种、型的识别，同时可了解致病菌的致病基因和耐药基因，以及寻找新的病原菌。目前基因芯片主要用于科研，要从实验室研究推向临床应用还有一系列问题需要解决。如提高特异性、简化操作、降低成本等。

（ 1 ）罗氏公司（ Roche Diagnostic Systems, Inc. ）发展的 Cobas Amplicor 系统。

（ 2 ）转录介导的扩增系统 [Gen-Probe transcription-mediated amplification (TMA ) system ]

（ 3 ）链接酶链式反应（ LCR ）

（ 4 ）链置换扩增（ SDA ）

　　目前病原体基因诊断在临床上最大的用途是检测难于培养的病原体。另一个用途是在治疗中将病毒载量检测作为疗效检测手段。第三个用途是治疗过程中检测耐药基因突变。第四是用于血液筛查。第五是用基因分型方法进行病原体种群分类。

　　免疫学标志有一定的敏感性和特异性，但不能定量。在确定病毒是否复制及抗病毒治疗监测方面荧光定量 PCR 具有很好的指导意义。在国内应用最广泛的病原体基因诊断项目。

　　在母婴传播的监控中 PQ-PCR 技术能快速、准确检测孕妇血中 HBV-DNA 的数量，医生可及时对患者进行诊断治疗，从而大大降低通过母婴传播 HBV 病毒的几率。

　　耐药突变监测室另一重要用途。抗病毒治疗是慢性乙型肝炎的根本治疗方法，基本治疗目标是清除或永久抑制乙型肝炎病毒的复制，降低致病性和传染性，消除或减轻肝脏的炎症和坏死。目前的抗病毒治疗药物主要是干扰素和以拉米夫定为代表的新一代核苷类似物。拉米夫定作为第一个获 FDA 批准的口服抗 HBV 药物，、其问世推动了慢性乙型肝炎治疗的进程。虽然拉密夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象。使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为 15-32% 、 38% 、 49% 、 66% 。因此，服药前期及服药期间监测 YMDD 的变化及 HBV DNA 含量就显得十分重要。拉米夫定耐药的主要原因是病毒多聚酶基因的 YMDD （酪氨酸－蛋氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸）区域发生突变，即由 YMDD 突变为 YIDD 或 YVDD ，从而产生耐药。蛋氨酸突变为异亮氨酸 Ⅰ或 缬 氨酸Ⅴ，氨基酸残基的侧链变短，结合域变大，从而降低了拉米夫定的亲和力，减弱拉米夫定对突变病毒复制的抑制能力。采用聚合酶链式反应（ PCR ）结合 Taqman 荧光探针技术，对血清中乙肝病毒拉米夫定耐药相关的多聚酶基因变异情况进行检测。监测乙型肝炎患者服用拉米夫定后体内是否产生耐药突变病毒，以此正确评估患者体内 HBV 病毒耐拉米夫定的情况。

　　HCV 是 RNA 病毒。实时荧光定量逆转录 PCR 可扩增 RNA ，检测 RNA 病毒并能加以定量。临床上须具备一种高敏感和准确定量 HCV 的方法来诊断和检测病人体内 HCV 病毒情况。实时荧光定量检测系统能达到这一要求。

　　肺结核是世界上最主要的传染病之一，每年造成超过 200 万人死亡和新增 800 万病人。由于病原体结合分支杆菌缓慢的生长率，分离、鉴定和药物敏感试验需数星期或很久。基于核酸扩增的分子生物学方法能将诊断时间大大缩短。实验证明，定量检测痰标本结核杆菌 DNA 与显微镜检查所得的抗酸杆菌（ AFB ）的数目相关性很好。在治疗开始之前，检测 AFB 、 TB DNA 和可培养的杆菌数十相似的，提示 DNA 定量是检测最初杆菌载量的好方法。然而， AFB 和 TB DNA 消失的速率都与可培养杆菌的下降不相关，以此不适合监测治疗效果。耐药的结核分支杆菌对于 TB 的控制是个严重的威胁。结核杆菌对一种或多种结核药物的耐药是发生基因突变及突变的积累所造成。以 PCR 为基础的 DNA 序列测定和基因芯片技术是快速检测 TB 耐药突变的有效方法。

　　CT 除致沙眼外，在临床上引起泌尿生殖道感染早已公认，且影响患者生活。但其细胞培养较难直接应用于临床检测。直接免疫荧光测定有一定主观因素。 PCR 克服了以上诸方面缺点。

　　病原体感染后的发病时间和病情轻重均与病原体数量有关。例如 HIV 感染后，潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量显著相关，甚至可根据 HIV 的量准确预测发病时间。病毒载量也是预测异性恋伴侣间 HIV 传播风险的主要因素，在 HIV-RNA 水平小于 1500 拷贝 /ml 时， HIV 的传播很少发生。

　　免疫受损人群包括爱滋、器官移植、恶性肿瘤、放射损伤等病人。器官移植病人使用免疫抑制剂造成免疫功能低下，易感染巨细胞病毒（ CMV ）、 EB 病毒等，使受者发病和死亡的重要原因。实时 PCR 可定量检测血液中病毒载量，有助于临床诊断病毒相关疾病和监测病人体内病毒变化情况。研究表明，以 1000 拷贝 /105 白细胞为预测 CMV 病症状发作的阈值，其敏感性为 35% ，特异性为 100% 。重要的是定量 PCR 分析法必须标准化，必须指定俞分析所用 DNA 量相当的细胞数，便于不同时间、不同实验室所得结果的比较研究。

　　血液筛查主要为免疫学方法。输血危险性来源于窗口期献血，病毒变异，非典型免疫应答和实验室检测的失误。 1999 年欧洲共同体、美国、日本相继把献血员筛查乙肝、丙肝、艾滋病毒。

　　研究表明，孕妇宫内感染弓形虫 TOX 、风疹病毒 RV 、巨细胞病毒 CMV 、单纯疱疹病毒 HSV 等病原体有可能引起胎儿发育异常。实时荧光定量 PCR 可检测孕妇羊水标本中病毒载量，作为是否终止妊娠的辅助指标。

　　HPV 感染已被流行病学和生物学证明，是引起子宫颈癌的重要因素。高危型 HPV （如 16 ， 18 型）持续感染能够提高子宫颈癌风险 250 倍。持续感染依赖于长期持续的高病毒载量。 HPV DNA 定量检测作为筛查手段将为降低癌发病率和死亡率起到积极作用。

　　EB 病毒与鼻咽癌的发生有密切俄相关性，被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。

　　EB 病毒的血清学检查一直是鼻咽癌的重要辅助诊断方法之一。研究发现运用实时定量 PCR 技术在 96% 的鼻咽癌病人和 7% 的正常对照血浆中检测到游离细胞 EB 病毒 DNA ，鼻咽癌患者血浆中游离细胞 EB 病毒 DNA 拷贝数明显高于正常对照组阳性者，且与临床分期、治疗效果和预后有很好的相关性。

　　应用核酸杂交、基因扩增、 DNA 序列测定及多态性分析技术可进行微生物的基因分型，该技术在微生物种群分类、基因结构分析、传染病的流行病学调查中均有较高的应用价值。

三、基因诊断试剂

1 、实验室自行配制的试剂， Home-brew assay-HB 。

　　可用于临床检测，多为人类基因检测项目，对实验室科研水平要求高，需严格的质量控制。

　　可用于科研，不能作为收费的临床检测项目。

　　试剂盒中不包括引物和探针，用于临床时需要类似 HB 的严格质量控制。

　　美国 FDA1996 年批准第一个用于病原体诊断的产品（沙眼衣原体 CT ）。我国 1999 年正式批准第一个用于临床的 PCR 试剂（乙肝病毒）。进口试剂价格昂贵，作为疾病常规检测手段难以承受。我国目前主要依赖于国产 PCR 试剂（表 1 ）。

表 1 已通过国家药品食品监督管理局（ SFDA ）审批的基因诊断试剂（截至到 2005 年 7 月）

四、关于实验室资格认证

　　开展病原体基因诊断的实验室需经过资格认证，实验人员要经过上岗培训。全国已有几百个实验室通过认证。北京市已通过卫生部临床检验中心资格认证的实验室见表 2 。希望开展病原体基因诊断的实验室主动积极地申请认证。外送标本的单位要送到有资质的实验室，以便保证临床基因诊断的质量。

表 2 北京市已通过卫生部临床检验中心资格认证的临床基因扩增检验实验室（截至到 2005 年 7 月）

五、病原体基因诊断的发展趋势

1 、提高自动化程度。从标本预处理、核酸提取到基因扩增和产物检测都有望实现自动化，可将人为误差降到最小，提高检测的精确度，提高工作效率。

2 、测定方法和工作程序的标准化。通过标准化改善实验室测定准确度，从而提高不同实验室间结果的可比性。

3 、在严密设计的临床应用研究基础上，确定每一个基因诊断项目适用得范围，避免滥用造成的困扰和不必要的费用。

4 、开发更加快捷廉价的检测方法。例如美国康奈尔大学报到一种不同于基因扩增的方法。先经加热酶解将核酸从血液细胞中释放出来，再将特制的测试棒置于其中停留几分钟。测试棒上注入了与被测病原体特异 RNA 片段精确匹配的 DNA 片段，如果待测 RNA 存在，他将与互补 DNA 结合并显示红色。该方法从开始到完成仅需 30 分钟。