各种荧光检测方法简介

1、流式: 优点是速度快，非常适合做大数量统计，且样品只被检测一次，完全不用担心荧光淬灭的问题。 缺点是只能检测荧光的有无、强度大小，无法提供空间定位信息，无法做荧光定位变化的实验；由于样品只被检测一次，因此无法对同一个样品进行连续观察。例如，做膜蛋白定位时会得到这么一个结果——用流式可以检测出信号，但是用显微镜却看不到东西，排除仪器和滤光片选择问题，很可能是核的自发荧光或非特异标记造成流式的假阳性结果。

2、荧光显微镜: 刚好与流式互补，可很好地进行空间观察，判断目标蛋白的定位，但是不适合做大流量检测，估计没人能经得起时间的考验。有不同倍率的物镜选择，可以使用高倍物镜看精细结构，或用小倍率物镜做少量统计。与之搭配的CCD和软件，是系统能否发挥性能的关键。尤其是CCD，从那么多商品里选一款合适的不容易，需要了解很多知识否则只能听别人忽悠。

3、共聚焦，荧光显微镜的升级产品: 具有很好的光学层切效果，能得到很好三维定位信息。但是，如果使用共聚焦的目的仅仅是为你的样品拍一张靓照，取得一张好看的图片，就让人觉得可惜了。共聚焦基本都是全自动系统，可随意定义照明区域、选择多个荧光通路和设定定时取图，所以，做Time-laps、FRAP和FRET有其独到的优势。另外，4Pi和STED又是其中的极品，具有超高的空间分辨率，只是使用不方便，未必适合做生物实验。

4、全内反射: 荧光显微镜的另一种升级产品，属于近场光学范畴，只适合且最适合做膜研究，无法看到胞内信息。也是用CCD成像，但是对CCD的要求更高——个人甚至觉得对CCD的要求是没有上限的。

5、双光子: 另一种共聚焦，因使用长波激发荧光，故能做深层检测（突破共聚焦的100微米极限），最典型的应用是观察活体脑组织。巨贵无比，国内没有几台，能用上的人不多。

6、新推出的高内涵药筛系统，流式和显微镜的杂合体: 使用电动载物台，可以自动地按预定程序完成实验，可做大流量检测（虽然速度慢点），而且有成像能力，可以判断定位。

 

来源：上海长征医院实验诊断科