（讨论）双重染色的再认识
丁香园论坛
3005
最近论坛对免疫组化双重染色的问题比较多，我想和大家集中讨论一下双重染色的一些要注意的问题。
免疫组化双重染色按标记物分：免疫荧光双重标记，免疫酶双重标记。免疫荧光双重标记因为我没做过，没有发言权，我目前主要是做免疫酶双重标记，接下来就我个人体会谈谈自己的一些看法（绝对原创）我所要讨论的是以下三个方面：
1 ：方法的选择
目前主要是平行两步法和序贯平行法：前者即同时加入两个不同种属的一抗，简而言之，就是两个抗原同时染；后者是分步来染这两个抗原，相对平行两步法来说，最大的优点就是两个一抗可以是同一种属，方便我们购买。此方法通常需要先染比较难以染上的抗原，再染相对容易一点的抗原。
另外序贯平行法，我建议将两种抗原单独分离出来做，一定要做稳定了，在进行组合。
2 ：显色剂的选择
这要根据你最后封片的方式来分类，中性树胶和水溶性两种，所以选择染色系统，两个抗原显色系统的染色剂在封片方式一定要统一。因为水性封片不能长久保存，所以最常用的是DAB和BCIP/NBT，复染选择核固红。 以下是显色剂的封片方式
中性树胶 水性
HRP DAB + —
AEC — +
AP BCIP/NBT + —
AP-RED — +
FAST RED — +
3 结果的评价
就我个人感觉，我做得是免疫细胞浆浆染色，其中还是同一个细胞胞浆中的两种抗原，所以难度很大。染色系统两个：过氧化物酶(DAB)和碱性磷酸酶（BCIP/NBT）。
最后效果不是很理想：第一，免疫细胞当中某些酶异常丰富，其中一个抗原DAB染出的颜色虽然说是棕黄色，但是高浓度的棕黄色聚在一起，颜色就略偏黑，这就和BCIP/NBT所染出得紫黑色不是很容易区别，尤其是在同一视野下，给人的感觉就是头皮发麻。第二，有些细胞染出的混合色也不是很容易辨别。
综上所述，大家如果选择双染的话，a：一定要选择核，浆，膜其中的任意不同两个，尽量不要是相同的部位，尤其不要是在一种细胞里面的两种相同部位的抗原。b：根据参考文献了解所要表达抗原丰富程度，来选择染色剂，比如我选择的这个DAB和 BCIP/NBT理论上行的通，实际却不是那么回事！
题外话：我曾经请教过病理科的老师，他们也不建议做双染，就算不同部位的抗原，最后结果看得不是很漂亮，可以说双重染色都是理论大于实际。
以上为我的一点愚见，不要见笑，大家多交流交流。请野原老大指点指点 ：）
免疫组化双重染色按标记物分：免疫荧光双重标记，免疫酶双重标记。免疫荧光双重标记因为我没做过，没有发言权，我目前主要是做免疫酶双重标记，接下来就我个人体会谈谈自己的一些看法（绝对原创）我所要讨论的是以下三个方面：
1 ：方法的选择
目前主要是平行两步法和序贯平行法：前者即同时加入两个不同种属的一抗，简而言之，就是两个抗原同时染；后者是分步来染这两个抗原，相对平行两步法来说，最大的优点就是两个一抗可以是同一种属，方便我们购买。此方法通常需要先染比较难以染上的抗原，再染相对容易一点的抗原。
另外序贯平行法，我建议将两种抗原单独分离出来做，一定要做稳定了，在进行组合。
2 ：显色剂的选择
这要根据你最后封片的方式来分类，中性树胶和水溶性两种，所以选择染色系统，两个抗原显色系统的染色剂在封片方式一定要统一。因为水性封片不能长久保存，所以最常用的是DAB和BCIP/NBT，复染选择核固红。 以下是显色剂的封片方式
中性树胶 水性
HRP DAB + —
AEC — +
AP BCIP/NBT + —
AP-RED — +
FAST RED — +
3 结果的评价
就我个人感觉，我做得是免疫细胞浆浆染色，其中还是同一个细胞胞浆中的两种抗原，所以难度很大。染色系统两个：过氧化物酶(DAB)和碱性磷酸酶（BCIP/NBT）。
最后效果不是很理想：第一，免疫细胞当中某些酶异常丰富，其中一个抗原DAB染出的颜色虽然说是棕黄色，但是高浓度的棕黄色聚在一起，颜色就略偏黑，这就和BCIP/NBT所染出得紫黑色不是很容易区别，尤其是在同一视野下，给人的感觉就是头皮发麻。第二，有些细胞染出的混合色也不是很容易辨别。
综上所述，大家如果选择双染的话，a：一定要选择核，浆，膜其中的任意不同两个，尽量不要是相同的部位，尤其不要是在一种细胞里面的两种相同部位的抗原。b：根据参考文献了解所要表达抗原丰富程度，来选择染色剂，比如我选择的这个DAB和 BCIP/NBT理论上行的通，实际却不是那么回事！
题外话：我曾经请教过病理科的老师，他们也不建议做双染，就算不同部位的抗原，最后结果看得不是很漂亮，可以说双重染色都是理论大于实际。
以上为我的一点愚见，不要见笑，大家多交流交流。请野原老大指点指点 ：）
