固相包被技术介绍

在许多固相免疫分析中，蛋白结合到塑料表面。通常是抗体结合，测抗原。结合抗原来测抗体。两种方法中，被固定的蛋白都被称为捕获蛋白。捕获蛋白直接结合到固相会引起结构的改变而降低免疫分析的亲和力。可通过二抗或亲和素等包被作为捕获蛋白。再结合一抗或经生物素修饰的蛋白。
蛋白的结合率范围从5%到95%，所以整个包被过程的处理非常重要。低的结合率会浪费蛋白，而过量结合又会影响免疫分析。蛋白的结合是依靠分子的疏水作用。分子由于疏水作用被挤向塑料表面从而发生吸附。
但分子蛋白的结合力较强。因为有更多的疏水位点，或是因为分子空间结构重新折叠从而暴露出更多的疏水位点而增加亲和力。如纤维蛋白，抗体等具有较高的亲和力。许多蛋白经糖基化，或在PH2-3溶液处理多可以改变极性或疏水位点以增加亲和力。
通常在蛋白浓度10-100ug/ml时浓度越大包被速度越快。浓度过高固相上的蛋白就会发生相互作用，甚至发生聚集。塑料表面的弱酸性环境可以促使免疫球蛋白的Fc片断与塑料结合。PH强度，离子强度，温度等都会影响包被的过程，通常37度最为合适。另外时间也是个影响因素。部分蛋白在最初的几分钟内就能发生快速的结合，而剩下的则需几小时。蛋白结合的数量由蛋白的大小和塑料表面的范围决定。较为理想的结合每平方厘米能达到0.5-1ug的IgG。
但是蛋白结合到塑料表面会改变其结构而降低免疫亲和力。蛋白在溶液中时其疏水位点在分子内部，当接近塑料表面是，疏水位垫被推向表面，与固相间的作用力由小变大。除了结构的改变，有的蛋白由于其活性位点在疏水位点附近因位阻作用而失活。
由于以上原因，传统ELISA方法建立在抗体或抗原依靠吸附作用结合到聚苯乙烯固相上，他有几个缺点，包括：1，一致性差，2，温育时间长，3，洗涤过程中造成的分子分离导致不可重复性，4灵敏度低。
相反，共价结合提高了灵敏度，降低了非特异结合而且消除了以上的缺点。Aleixo 等介绍了对苯环进行硝化处理在进一步使之氨化从而引入一个活性基团。氨基苯环容易发生化学反应如重氮化作用共价结合固定抗原。同样功能基团也可以通过嫁接或者气液技术得到。但是这些方法都很繁琐和耗时间。因此需要简单温和的方法使蛋白共价结合到微孔板上，这在诊断及相关领域都有很大的潜力。
Nahar等发现了一种快速简单的方法就是利用FNAB（1-氟-2硝基-4-叠氮苯）的光化学反应。通过对聚苯乙烯微孔滴定板进行简单的光化学预处理提高了ELISA的速度和灵敏度。Epicoccum nigrum antigen（过敏抗原）或羊抗鼠在45分钟内在经过处理的微孔板上的吸收远远超过未经处理的表面。在ELISA分析中经过处理的板的计数是未经处理的1.5-2倍。而且经过处理的固相能够测出体积比1/50的溶液中的IgE。但1/5稀释后在经过处理的板上能测出的值是未经处理的板的3倍。这种表面的处理在酶联分析（尤其是对假阴性的判断）和方面分析中都很重要。