【旧贴整理】

前几天看到loveyingzi 在PCR技术讨论版有一个旧贴子。 [我快急死了,用细菌16SrRNA通用的引物扩增兔附红细胞体,结果测了2次序都不是,第一次测出来是葡萄球菌,第二次测出来是木糖氧化无色杆菌,可我对提基因组用的菌液镜检,还有划板培养都没发现污染的杂菌,面临毕业的问题,高手快快帮忙,谢谢.急!急!急!如果测序不出差错的话,那我提基因组肯定有问题,请问有谁提过附红细胞体的基因组?]
我是一名普通的兽医(E-mail: ydfyfdquam@163.com)，了解过一点附红细胞体。首先，loveyingzi选择研究的兔作为附红细胞体的研究动物，可能不妥。虽然我国于1981年晋希民教授就发现了家兔的附红细胞体，可是那毕竟是形态学的观测。随着最近十几年的分子生物学的发现，很多学者都以16SrRNA的基因序列来作为原核生物的鉴定基因，并且国内外的学者相继报导了多种动物体内扩增出的附红细胞体的16SrRNA基因序列，但是NCBI还没有收录免附红细胞体的16SrRNA基因序列（人或鸡的好象也没有收录）。如果真的能够扩增出来，那是世界首次报道，一定可以发SCI论文了。不过也不是没有可能，发现免交叉其它动物的附红细胞体也可能，比如有论文发现犬血中可以检测出猫的附红细胞体（相对准确的名字叫猫血巴通体Haemobartonella felis）的16SrRNA基因序列。
再说一下loveyingzi所谈到的问题。我们知道，血液中常常感染一些细菌，如大肠杆菌或葡萄球菌等，既然你是用的16SrRNA通用的引物，那难免会同时扩增细菌的16SrRNA基因。在普通的琼脂糖电泳中，你扩增的1500bp的条带可能是细菌或附红细胞体16SrRNA基因序列的混合物。我相信你没有污染，但是你连接转化后应通过酶切等鉴定方法，选出你要的克隆子（很有可能选几十个都选不中）。提附红细胞体基因组DNA应该很简单，但是常规的提取血液基因组的试剂盒不能用，因为这些方法里都会有红细胞洗脱液洗去红细胞（而我们要的就是附在红细胞上的细胞体）。除了鸡红细胞有细胞核以外，其它动物血液中只有白细胞才有细胞核，，也就是说我们常用的血DNA提取方法都是提取的是白细胞DNA的。
我想和大家讨论一下：关于附红细胞体的研究，为什么这么热，相关论文那么多，而国外仅有几个国家的研究单位在作相关研究。
1．我觉得不是所有动物都发现有附红细胞体的，不是说从鸡上用光镜观察得到的就叫鸡附红细胞体，以及人血中发现人的附红细胞体，太主观了。16SrRNA基因序列都扩增不出来，大多应是被国内的学者吹出来的吧（Linda M.B.在它的论文里面就谈到，人的附红细胞体只有中国和非洲有少量相关的论文报导，相关的英文文献就10来篇不到）。另外，我引用一篇会议论文里的话（附红细胞体无处不在，“取一小块天上下的大雪放在镜片上，加生理盐水后都可以镜检看到附红细胞体”）。
2．附红细胞体研究论文不少，为什么没有人好好的扩增一下16SrRNA基因，再比对一下，就发表论文谈到：体检发现，大连地区的2000多名新兵的附红细胞体的感染率为100%，我们共和国的卫士有那么多病吗？
3．很多关于不同动物之间附红细胞体交叉感染的论文，比如牛附红细胞体可以感染猫。我们知道牛的附红细胞体和猫的附红细胞体16SrRNA基因序列的差异性是很大的，感染的是否成功，不能仅看显微镜主观感觉（我们是研究工作者）。猫感染了牛的附红细胞体之后，16SrRNA基因序列有什么变化？感染猫上发现的附红细胞体的是牛的附红细胞体还是猫的附红细胞体的16SrRNA基因，为什么不比对一下？这些问题，为什么没有讨论一下？
4．在附红细胞体的电镜观察和体外培养的研究上，国外仍没有较成功的体外培养，为什么国内很多论文都说自己培养出了附红细胞体。抽提过DNA，鉴定过16SrRNA基因序列吗？
5．附红细胞体还有很多病原学的基础研究还没明白，致病基理也不是很清楚，是否能体外培养也是问题，有很多论文就说附红细胞体的抗原己经纯化出来了，做出了疫苗？
最后，我觉得很多论文误导了大家。我希望大家看一下花象柏老先生的论文《广泛报道的所谓“猪附红细胞体病”存在误导问题》，写得真好。