【专题讨论】一个蛋白原核表达纯化出现的问题,高手们请进来讨论下.
丁香园论坛
2171
最近很郁闷,非常郁闷!!!明天就要去考博了,现在实验出现这种奇怪的事,郁闷啊!大家别急,我详细的说说我遇到的问题.
一直在表达纯化蛋白.一共两种,都是一起做的.其中有一个没什么问题,顺顺利利.没什么好说的.现在说说另一个.这个问题蛋白呢,基因是我们实验室自己克隆的,genebank登录号AF188239.338个氨基酸.预测有两个跨膜域.其中这个蛋白有19个半胱氨酸残基!!!!!!(这是我后面发现有问题,自己一个一个去对发现有很多半胱氨酸残基.)
好了,开始做诱导.pet-28b载体,bl21(de3)宿主菌.没做出来.后来做了第二个跨膜区的突变体,用rosttablue(DE3)做宿主菌.出来了,是包涵体.效果不错.但是全长用rosttablue(DE3)做宿主菌.还是没出来.接下来就用突变体大量诱导,盐酸胍溶解,过his柱,透析得到大量黄色沉淀.这里提一下,当时过柱子是用的是tris缓冲液,20mM咪唑洗柱,1M咪唑洗蛋白下来.把得到的黄色沉淀跑个sds胶.蛋白都降解了.因为当时从诱导到纯化拖的时间长20多天吧,而且透析在常温下进行的,透析了两天.
降解了,就只有重做了.这里提一下当时用的跑胶的loading buffer都用完了,新配的,由于DTT不够,所一新配的loading buffer实际上的DTT浓度是原来用的2/3.
好了,现在开始不断出问题了.重新做诱导跑胶,发现原来诱导的出来的蛋白现在出不来了.于是我又做了几次,培养基,抗生素,重新画板挑的克隆,新的iptg.都换了,蛋白就是不出来了.我晕死.最后我发现后面每次跑胶,上样孔里总有一些白色沉淀.我就想了这会不会是我的蛋白.于是我分析了蛋白序列发现有19个半胱氨酸残基,那么是不是我的loading buffer里dtt少了,蛋白不能完全变性呢?我于是重新配了正常的dtt的loading buffer,又做了诱导,跑了个胶.这次出来了,但是位置不对,比以前靠下.我又跑了次胶,这次同一种样品一种沉淀直接加loading buffer煮5分钟,一种在沉淀里加5%的SDS,和2MDTT再加loading buffer煮5分钟.这次终于出来了,后一种处理的样品即大量SDS和DTT处理的,上样孔里没有沉淀.,而且胶上的位置也正确.以前没诱导出来的样品这样处理的,蛋白都出来了.这下好了,我总算松了口气.
接着过柱子纯化,这一次我是用PBS缓冲液,20mM咪唑和50mM咪唑洗柱,500mM咪唑洗蛋白,PBS缓冲液透析ph7.4这次得到了是白色沉淀.沉淀20微升跑个胶,什么都没有!!!!我晕.沉淀量很多得啊,我另外一个蛋白一起做也是白色沉淀20微升跑胶,蛋白很多一大块很纯,两个蛋白在一个胶上跑的,怎么这一个就什么都没有呢,白板!!!!!!!.昨天我又跑了次胶用的20微升,10微升,5微升沉淀分别不同的处理,一组是直接加loading buffer煮5分钟,一组5%的SDS,和2MDTT再加loading buffer煮5分钟.结果只有10微升直接加loading buffer煮5分钟这个在哪个位置出现了一条带.各位大虾,我的蛋白那里去了,难到透析袋里的不是我的蛋白.
?就算是其他蛋白也应该有条带啊,不会是白板啊?又或沉淀不是蛋白?但是10微升直接加loading buffer煮5分钟又出现了一点呢?而且另外一个蛋白一起做也是白色沉淀20微升跑胶,蛋白很多一大块很纯,两个蛋白在一个胶上跑的.如果那些沉淀是盐分的化,应该溶于PBS啊.这些沉淀不溶 .但是溶于5%的SDS,和2MDTT的混合液中.但是跑出来就是白板!!!白板啊,我晕.以上都是用考染.
我现在考虑,一,考染染不了我的蛋白???二装蛋白的PE管在蛋白溶了以后吸付我的蛋白???我实在想不到是什么原因了,大家帮忙.郁闷中!!!!
一直在表达纯化蛋白.一共两种,都是一起做的.其中有一个没什么问题,顺顺利利.没什么好说的.现在说说另一个.这个问题蛋白呢,基因是我们实验室自己克隆的,genebank登录号AF188239.338个氨基酸.预测有两个跨膜域.其中这个蛋白有19个半胱氨酸残基!!!!!!(这是我后面发现有问题,自己一个一个去对发现有很多半胱氨酸残基.)
好了,开始做诱导.pet-28b载体,bl21(de3)宿主菌.没做出来.后来做了第二个跨膜区的突变体,用rosttablue(DE3)做宿主菌.出来了,是包涵体.效果不错.但是全长用rosttablue(DE3)做宿主菌.还是没出来.接下来就用突变体大量诱导,盐酸胍溶解,过his柱,透析得到大量黄色沉淀.这里提一下,当时过柱子是用的是tris缓冲液,20mM咪唑洗柱,1M咪唑洗蛋白下来.把得到的黄色沉淀跑个sds胶.蛋白都降解了.因为当时从诱导到纯化拖的时间长20多天吧,而且透析在常温下进行的,透析了两天.
降解了,就只有重做了.这里提一下当时用的跑胶的loading buffer都用完了,新配的,由于DTT不够,所一新配的loading buffer实际上的DTT浓度是原来用的2/3.
好了,现在开始不断出问题了.重新做诱导跑胶,发现原来诱导的出来的蛋白现在出不来了.于是我又做了几次,培养基,抗生素,重新画板挑的克隆,新的iptg.都换了,蛋白就是不出来了.我晕死.最后我发现后面每次跑胶,上样孔里总有一些白色沉淀.我就想了这会不会是我的蛋白.于是我分析了蛋白序列发现有19个半胱氨酸残基,那么是不是我的loading buffer里dtt少了,蛋白不能完全变性呢?我于是重新配了正常的dtt的loading buffer,又做了诱导,跑了个胶.这次出来了,但是位置不对,比以前靠下.我又跑了次胶,这次同一种样品一种沉淀直接加loading buffer煮5分钟,一种在沉淀里加5%的SDS,和2MDTT再加loading buffer煮5分钟.这次终于出来了,后一种处理的样品即大量SDS和DTT处理的,上样孔里没有沉淀.,而且胶上的位置也正确.以前没诱导出来的样品这样处理的,蛋白都出来了.这下好了,我总算松了口气.
接着过柱子纯化,这一次我是用PBS缓冲液,20mM咪唑和50mM咪唑洗柱,500mM咪唑洗蛋白,PBS缓冲液透析ph7.4这次得到了是白色沉淀.沉淀20微升跑个胶,什么都没有!!!!我晕.沉淀量很多得啊,我另外一个蛋白一起做也是白色沉淀20微升跑胶,蛋白很多一大块很纯,两个蛋白在一个胶上跑的,怎么这一个就什么都没有呢,白板!!!!!!!.昨天我又跑了次胶用的20微升,10微升,5微升沉淀分别不同的处理,一组是直接加loading buffer煮5分钟,一组5%的SDS,和2MDTT再加loading buffer煮5分钟.结果只有10微升直接加loading buffer煮5分钟这个在哪个位置出现了一条带.各位大虾,我的蛋白那里去了,难到透析袋里的不是我的蛋白.
?就算是其他蛋白也应该有条带啊,不会是白板啊?又或沉淀不是蛋白?但是10微升直接加loading buffer煮5分钟又出现了一点呢?而且另外一个蛋白一起做也是白色沉淀20微升跑胶,蛋白很多一大块很纯,两个蛋白在一个胶上跑的.如果那些沉淀是盐分的化,应该溶于PBS啊.这些沉淀不溶 .但是溶于5%的SDS,和2MDTT的混合液中.但是跑出来就是白板!!!白板啊,我晕.以上都是用考染.
我现在考虑,一,考染染不了我的蛋白???二装蛋白的PE管在蛋白溶了以后吸付我的蛋白???我实在想不到是什么原因了,大家帮忙.郁闷中!!!!
