翻译调控
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翻译调控——连接基因组学和蛋白质组学的有效手段
摘要：在细胞内，蛋白质水平和mRNA水平是不一致吻合的。对蛋白质合成的 调控不仅局限于转录过程，翻译阶段也有一部分调节作用，mRNA的水平不能完全代表蛋白质水平。应用蛋白质双向电泳等方法分离蛋白质存在许多缺点，因此，利用蔗糖密度梯度离心的方法研究在翻译过程中的蛋白质调控是有意义的。只有核糖体结合的mRNA才可以翻译成蛋白质，而游离的mRNA在翻译中不起作用。
关键词 翻译调控 基因组学 蛋白质组学
随着人类基因组草图的完成，人们发现人类基因比蛋白质数量要少得多，只有3~4万个基因，而每个基因都可以编码1~8个蛋白质。酵母哺乳动物细胞分析表明，基因转录的mRNA水平并不能完全可靠的代表其相应蛋白质的丰度。这种mRNA水平和蛋白质丰度之间的差别揭示：除了在转录过程中，在蛋白质合成的其他阶段也存在调控机制。翻译调控（translational control）在控制基因表达方面起重要作用，实际上用翻译的mRNA描述蛋白质组比用总mRNA表述转录水平要准确得多。这将使基因组学和蛋白质组学最终联系起来。
在细胞内，是蛋白质而不是基因或其转录产物mRNA决定细胞基因表型及对外信息发生的反应性。蛋白质水平的表达不仅取决于基因转录的速率，也与mRNA的出核、细胞浆定位、转录物的稳定性、mRNA翻译调节及蛋白质的降解密切相关。此外，蛋白质的生物活性及功能，主要通过翻译后加工如糖基化、磷酸化及蛋白酶的水解而发生改变。在过去的20年中，转录和翻译后加工吸引众多学者关注，成为研究热点；相反，mRNA的翻译调控作用却被低估而受到冷遇。近年来，人们对控制mRNA翻译机理的研究逐渐增多，发现翻译调控作用十分广泛，而且mRNA翻译起始是控制翻译效率的限速步骤。这涉及到集体的mRNA结构的变化、翻译各组成成分的修饰，以及与其他蛋白质相互作用等。例如：T细胞激活后也有20%基因表达的改变是在翻译水平实现的，这促使人们认识到，若将翻译水平的调控基因也弄清，可极大程度改善基因转录的mRNA丰度和分布图谱的准确性。
1．mRNA表达水平是否准确反映蛋白质丰度
在过去的十几年中，多数研究人员皆以基因mRNA表达的丰度代表其编码蛋白质的水平及其基因表型。但事实上并非如此。研究表明，在稳恒状态下的mRNA的丰度与相应蛋白质水平相差极大，这往往导致我们错误的了解mRNA表达水平所得到的结果。人们在研究酵母中发现，某种基因mRNA的丰度和相应翻译的蛋白质水平可相差30倍之多，而且在低丰度蛋白质中更加明显。直接比较哺乳动物一种组织的数种基因或一个基因在不同组织中编码蛋白质和mRNA的水平发现，在任意情况下，相关系数都小于0.5，而且在肿瘤细胞中更低。上述证据表明，从mRNA推测其相应蛋白质的丰度是不可靠的。同样，以mRNA的水平来解释细胞的基因表型也是不可行的。
mRNA和蛋白质无论在单个基因还是在整个细胞系中相关系数一般小于0.5，它们之间的差别最高可达30倍。
2．目前蛋白质组学方法学的局限性
为克服上述困难，最有效的方法就是在蛋白质水平定位、定量分析某种组织细胞全部基因的表达水平，这就是蛋白质组学的重要目的。通常用的方法是用蛋白质双向电泳分离细胞中的全部蛋白质，随后用质谱仪定性定量每种蛋白。最近应用这种技术，已经找到数种肿瘤和恶性血液病的标记蛋白，也发现在心脏疾患中下调的蛋白质，以及评定环境污染物的毒性作用，但令人遗憾的是，蛋白质组学应用的技术上存在缺陷，最明显的是双向电泳的分辨率。目前，应用最先进的荧光显色方法也仅能分辨出3000~4000种蛋白（仅为整个蛋白质组的20%），对低丰度的蛋白质来说，存在一定偏差。在基因组中，可以利用消减处理选出高表达的mRNA，低表达的可以通过PCR技术进行扩增。但是，在蛋白质组中，没有类似的方法。结果，许多具有重要调节功能的蛋白质，如细胞质子及其受体、细胞周期调节蛋白、细胞内信号传导蛋白以及转录因子都不能分离鉴定。此外，对于某些碱性的、疏水的以及分子量过大或过小的蛋白质的测定也存在一定困难。因此，上述技术仅实用于分离鉴定亚细胞组分，如细胞膜、细胞器、胞浆和核内容物，而不能全部鉴定出整个蛋白质组。然而，随着双向电泳分离方法的改进，以及新技术如同位素标记特异蛋白、标记物定量分析蛋白质方法的出现，可望在不久的将来克服上述不足。
3． 寻找更确切的蛋白质组的方法
从上述事实可以得出一个结论，mRNA的量只有在转录物全部被翻译时，才成为表达分布图中有意义的蛋白。这些参与翻译的mRNA可以通过蔗糖密度梯度离心（130，000转/分，2h, 4℃）分离胞浆提取物得到。利用蔗糖密度梯度离心在核糖体前其实复合物的RNA和装配了核糖体的mRNA，分离出游离的mRNA，这样就可以区分游离的mRNA与参与翻译的mRNA。并且，由于翻译过程的限速步骤是翻译起始阶段，所以，与核糖体相结合的mRNA分子数目可以准确的表示出相应的蛋白质合成率。
众所周知，mRNA须与胞浆中核糖体组成复合物（Polsome-bound mRNA）后方能进行翻译，而用蔗糖密度梯度离心技术可将游离的未翻译的mRNA与前者分离。将与核糖体结合成复合物的mRNA制备成探针，用于基因芯片进行杂交。用这种方法分析发现，小鼠和人的成纤维细胞在血清诱导的分裂过程中约有10%的基因实在翻译水平调控的。同时还发现含有核糖体结合位点的mRNA占全部转录产物的3%，这一技术的关键时确定其可靠性和重复性。由同一种细胞分别分离出总mRNA、游离mRNA和与核糖体结合的mRNA，反转录成cDNA后分别与基因芯片杂交。结果发现，后两者相加的阳性信号与总mRNA的阳性信号完全呈正相关（相关系数为1）。从而表明：①利用核糖体结合的mRNA可以产生可重复的定量结果；②总mRNA水平不能代表可翻译的mRNA种类和水平；③通过比较总mRNA和核糖体结合mRNA的阳性信号，可区分基因是在转录水平或翻译水平调节。
应用此种方法分析上皮细胞在转化过程中级小鼠红系祖细胞分化及对细胞因子反应中发现，虽然多数基因是在转录水平调节的，但也有10％-20%的基因是通过翻译过程改变的。因此，若仅仅应用常规的基因表达研究方法，将不能观察到这部分基因表达的变化。应用蛋白质印记杂交的方法观察相应蛋白质水平的变化进一步证实上述10％－20%基因确实是在翻译水平调节的。显而易见，在分布图的分析中，结合核糖体的mRNA将比总mRNA与蛋白质的相关性更大。
综上所述，分析核糖体结合的mRNA在基因芯片上的阳性信号，比使用总mRNA更能充分反映基因转录。mRNA成熟、出核、稳定性和翻译等一系列过程都影响了最终蛋白质的合成速率。利用蔗糖密度梯度离心分离出核糖体结合mRNA可以应用在mRNA分布图中作定量分析。这种理论结合了基因组技术的高产量、可行性、可重复性、敏感性、对新细胞系统的适应性和蛋白质分析技术。与此同时，也应当看到分析核糖体结合的mRNA尚不能用于研究蛋白质的水解、翻译后修饰，但至少部分的弥补了基因组学和蛋白质组学的空间。而数量众多的基因表达通过翻译过程也将极大的促进对其机理进一步阐明。
这篇综述是我阅读中的一点心得，发表于《生物学通报》上，请各位专家指教。
摘要：在细胞内，蛋白质水平和mRNA水平是不一致吻合的。对蛋白质合成的 调控不仅局限于转录过程，翻译阶段也有一部分调节作用，mRNA的水平不能完全代表蛋白质水平。应用蛋白质双向电泳等方法分离蛋白质存在许多缺点，因此，利用蔗糖密度梯度离心的方法研究在翻译过程中的蛋白质调控是有意义的。只有核糖体结合的mRNA才可以翻译成蛋白质，而游离的mRNA在翻译中不起作用。
关键词 翻译调控 基因组学 蛋白质组学
随着人类基因组草图的完成，人们发现人类基因比蛋白质数量要少得多，只有3~4万个基因，而每个基因都可以编码1~8个蛋白质。酵母哺乳动物细胞分析表明，基因转录的mRNA水平并不能完全可靠的代表其相应蛋白质的丰度。这种mRNA水平和蛋白质丰度之间的差别揭示：除了在转录过程中，在蛋白质合成的其他阶段也存在调控机制。翻译调控（translational control）在控制基因表达方面起重要作用，实际上用翻译的mRNA描述蛋白质组比用总mRNA表述转录水平要准确得多。这将使基因组学和蛋白质组学最终联系起来。
在细胞内，是蛋白质而不是基因或其转录产物mRNA决定细胞基因表型及对外信息发生的反应性。蛋白质水平的表达不仅取决于基因转录的速率，也与mRNA的出核、细胞浆定位、转录物的稳定性、mRNA翻译调节及蛋白质的降解密切相关。此外，蛋白质的生物活性及功能，主要通过翻译后加工如糖基化、磷酸化及蛋白酶的水解而发生改变。在过去的20年中，转录和翻译后加工吸引众多学者关注，成为研究热点；相反，mRNA的翻译调控作用却被低估而受到冷遇。近年来，人们对控制mRNA翻译机理的研究逐渐增多，发现翻译调控作用十分广泛，而且mRNA翻译起始是控制翻译效率的限速步骤。这涉及到集体的mRNA结构的变化、翻译各组成成分的修饰，以及与其他蛋白质相互作用等。例如：T细胞激活后也有20%基因表达的改变是在翻译水平实现的，这促使人们认识到，若将翻译水平的调控基因也弄清，可极大程度改善基因转录的mRNA丰度和分布图谱的准确性。
1．mRNA表达水平是否准确反映蛋白质丰度
在过去的十几年中，多数研究人员皆以基因mRNA表达的丰度代表其编码蛋白质的水平及其基因表型。但事实上并非如此。研究表明，在稳恒状态下的mRNA的丰度与相应蛋白质水平相差极大，这往往导致我们错误的了解mRNA表达水平所得到的结果。人们在研究酵母中发现，某种基因mRNA的丰度和相应翻译的蛋白质水平可相差30倍之多，而且在低丰度蛋白质中更加明显。直接比较哺乳动物一种组织的数种基因或一个基因在不同组织中编码蛋白质和mRNA的水平发现，在任意情况下，相关系数都小于0.5，而且在肿瘤细胞中更低。上述证据表明，从mRNA推测其相应蛋白质的丰度是不可靠的。同样，以mRNA的水平来解释细胞的基因表型也是不可行的。
mRNA和蛋白质无论在单个基因还是在整个细胞系中相关系数一般小于0.5，它们之间的差别最高可达30倍。
2．目前蛋白质组学方法学的局限性
为克服上述困难，最有效的方法就是在蛋白质水平定位、定量分析某种组织细胞全部基因的表达水平，这就是蛋白质组学的重要目的。通常用的方法是用蛋白质双向电泳分离细胞中的全部蛋白质，随后用质谱仪定性定量每种蛋白。最近应用这种技术，已经找到数种肿瘤和恶性血液病的标记蛋白，也发现在心脏疾患中下调的蛋白质，以及评定环境污染物的毒性作用，但令人遗憾的是，蛋白质组学应用的技术上存在缺陷，最明显的是双向电泳的分辨率。目前，应用最先进的荧光显色方法也仅能分辨出3000~4000种蛋白（仅为整个蛋白质组的20%），对低丰度的蛋白质来说，存在一定偏差。在基因组中，可以利用消减处理选出高表达的mRNA，低表达的可以通过PCR技术进行扩增。但是，在蛋白质组中，没有类似的方法。结果，许多具有重要调节功能的蛋白质，如细胞质子及其受体、细胞周期调节蛋白、细胞内信号传导蛋白以及转录因子都不能分离鉴定。此外，对于某些碱性的、疏水的以及分子量过大或过小的蛋白质的测定也存在一定困难。因此，上述技术仅实用于分离鉴定亚细胞组分，如细胞膜、细胞器、胞浆和核内容物，而不能全部鉴定出整个蛋白质组。然而，随着双向电泳分离方法的改进，以及新技术如同位素标记特异蛋白、标记物定量分析蛋白质方法的出现，可望在不久的将来克服上述不足。
3． 寻找更确切的蛋白质组的方法
从上述事实可以得出一个结论，mRNA的量只有在转录物全部被翻译时，才成为表达分布图中有意义的蛋白。这些参与翻译的mRNA可以通过蔗糖密度梯度离心（130，000转/分，2h, 4℃）分离胞浆提取物得到。利用蔗糖密度梯度离心在核糖体前其实复合物的RNA和装配了核糖体的mRNA，分离出游离的mRNA，这样就可以区分游离的mRNA与参与翻译的mRNA。并且，由于翻译过程的限速步骤是翻译起始阶段，所以，与核糖体相结合的mRNA分子数目可以准确的表示出相应的蛋白质合成率。
众所周知，mRNA须与胞浆中核糖体组成复合物（Polsome-bound mRNA）后方能进行翻译，而用蔗糖密度梯度离心技术可将游离的未翻译的mRNA与前者分离。将与核糖体结合成复合物的mRNA制备成探针，用于基因芯片进行杂交。用这种方法分析发现，小鼠和人的成纤维细胞在血清诱导的分裂过程中约有10%的基因实在翻译水平调控的。同时还发现含有核糖体结合位点的mRNA占全部转录产物的3%，这一技术的关键时确定其可靠性和重复性。由同一种细胞分别分离出总mRNA、游离mRNA和与核糖体结合的mRNA，反转录成cDNA后分别与基因芯片杂交。结果发现，后两者相加的阳性信号与总mRNA的阳性信号完全呈正相关（相关系数为1）。从而表明：①利用核糖体结合的mRNA可以产生可重复的定量结果；②总mRNA水平不能代表可翻译的mRNA种类和水平；③通过比较总mRNA和核糖体结合mRNA的阳性信号，可区分基因是在转录水平或翻译水平调节。
应用此种方法分析上皮细胞在转化过程中级小鼠红系祖细胞分化及对细胞因子反应中发现，虽然多数基因是在转录水平调节的，但也有10％-20%的基因是通过翻译过程改变的。因此，若仅仅应用常规的基因表达研究方法，将不能观察到这部分基因表达的变化。应用蛋白质印记杂交的方法观察相应蛋白质水平的变化进一步证实上述10％－20%基因确实是在翻译水平调节的。显而易见，在分布图的分析中，结合核糖体的mRNA将比总mRNA与蛋白质的相关性更大。
综上所述，分析核糖体结合的mRNA在基因芯片上的阳性信号，比使用总mRNA更能充分反映基因转录。mRNA成熟、出核、稳定性和翻译等一系列过程都影响了最终蛋白质的合成速率。利用蔗糖密度梯度离心分离出核糖体结合mRNA可以应用在mRNA分布图中作定量分析。这种理论结合了基因组技术的高产量、可行性、可重复性、敏感性、对新细胞系统的适应性和蛋白质分析技术。与此同时，也应当看到分析核糖体结合的mRNA尚不能用于研究蛋白质的水解、翻译后修饰，但至少部分的弥补了基因组学和蛋白质组学的空间。而数量众多的基因表达通过翻译过程也将极大的促进对其机理进一步阐明。
这篇综述是我阅读中的一点心得，发表于《生物学通报》上，请各位专家指教。
