超声帖子要点总结
丁香园论坛
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1,超声效果判定:
a)一般要在超的过程中监测,超几下就做个玻片染色,在你的视野里应该还能看到几个没有破碎的菌才行,没有这样完好的菌存在就说明你超过了,蛋白就会完蛋了。监测几次就有经验了,也不用每次都染就行了。最简单的方法:涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察
切记:只用结晶紫染色,别忘了染色后再用水稍冲洗一下
b)我们的作法是:在第一次使用超声破碎仪时监测OD600以确定功率和时间,取5微升样品加入1毫升水,OD600降到起始值的10%以下时说明破菌完成。
c)一般超声后菌液感觉变得更透明了
d)超声好的样品轻旋时明显感觉到不是很粘的,离心后沉淀体积也明显小于当初的细胞沉淀体积。
2注意事项:
a)另外,在超声过程中要避免产生气泡,超声头要伸入液面以下一段距离。
b)产热蛋白变性是会起泡沫或颜色变黑,超声是一个产热过程,应该把离心管置于冰浴中超声,
另外,一定要冰水浴,而且水要多于冰,因为水的传热强于冰。因为离心管的散热性不好,使冰水浴的效果下降,建议使用小烧杯。
c)功率选择根据超声的体积,体积大者功率大,宜选用不起泡沫情况下的最大值为宜,我的经验中10毫升管200W没问题;超声仪上应该有一个调功率的旋钮,超声的功率也不能太大,否则也容易碳化,一般不需要用最大的频率。tune应该是调功率的,我记得以前旋纽的位置是低于1/2的.
另外要保证间歇时间大于超声时间,根据相应的文献确定这两个具体的时间。
3,例子
a)我以前做蛋白大量表达超声破碎时,总体积为200ml,功率300瓦,超3秒,停3秒,60次为一个循环,每个循环之间停5min,共作了3个循环,效果很好。
b)超声可以小量,按1:4 PBS重悬菌体,在1.5 ml 离心管里用0.5 ml悬液, 70W 15秒,停30秒,再15秒, 差不多了, 也可以用10 ml管, 不过会产热不均匀, 最好用大的超声探头.
c)我的经验是超10秒停10秒,总共超声5分钟足矣。
经验值是楼主的10毫升(1克菌)体系200W超声3到5分钟(不包括间歇时间)足矣。
d)我使用的条件是工作5s,停15s,一共20m.但是不同的超声波破碎仪功率是不一样的,仅仅用超声频率来描述工作条件是不够的。你提到的“需要15分钟”,我认为是指工作和停止的时间加起来15分钟,不是指超声累计15分钟。
e)这是一个实验室的超声条件:
300W, 超2秒,间隔2秒,重复99次
你可以试试超1秒停1秒或超0.5秒停1秒,总超声时间(不是总时间)在十分钟左右,另外,你用10ML离心管的话功率差不多200W就可以了,
以上均从网友的帖子中摘录
a)一般要在超的过程中监测,超几下就做个玻片染色,在你的视野里应该还能看到几个没有破碎的菌才行,没有这样完好的菌存在就说明你超过了,蛋白就会完蛋了。监测几次就有经验了,也不用每次都染就行了。最简单的方法:涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察
切记:只用结晶紫染色,别忘了染色后再用水稍冲洗一下
b)我们的作法是:在第一次使用超声破碎仪时监测OD600以确定功率和时间,取5微升样品加入1毫升水,OD600降到起始值的10%以下时说明破菌完成。
c)一般超声后菌液感觉变得更透明了
d)超声好的样品轻旋时明显感觉到不是很粘的,离心后沉淀体积也明显小于当初的细胞沉淀体积。
2注意事项:
a)另外,在超声过程中要避免产生气泡,超声头要伸入液面以下一段距离。
b)产热蛋白变性是会起泡沫或颜色变黑,超声是一个产热过程,应该把离心管置于冰浴中超声,
另外,一定要冰水浴,而且水要多于冰,因为水的传热强于冰。因为离心管的散热性不好,使冰水浴的效果下降,建议使用小烧杯。
c)功率选择根据超声的体积,体积大者功率大,宜选用不起泡沫情况下的最大值为宜,我的经验中10毫升管200W没问题;超声仪上应该有一个调功率的旋钮,超声的功率也不能太大,否则也容易碳化,一般不需要用最大的频率。tune应该是调功率的,我记得以前旋纽的位置是低于1/2的.
另外要保证间歇时间大于超声时间,根据相应的文献确定这两个具体的时间。
3,例子
a)我以前做蛋白大量表达超声破碎时,总体积为200ml,功率300瓦,超3秒,停3秒,60次为一个循环,每个循环之间停5min,共作了3个循环,效果很好。
b)超声可以小量,按1:4 PBS重悬菌体,在1.5 ml 离心管里用0.5 ml悬液, 70W 15秒,停30秒,再15秒, 差不多了, 也可以用10 ml管, 不过会产热不均匀, 最好用大的超声探头.
c)我的经验是超10秒停10秒,总共超声5分钟足矣。
经验值是楼主的10毫升(1克菌)体系200W超声3到5分钟(不包括间歇时间)足矣。
d)我使用的条件是工作5s,停15s,一共20m.但是不同的超声波破碎仪功率是不一样的,仅仅用超声频率来描述工作条件是不够的。你提到的“需要15分钟”,我认为是指工作和停止的时间加起来15分钟,不是指超声累计15分钟。
e)这是一个实验室的超声条件:
300W, 超2秒,间隔2秒,重复99次
你可以试试超1秒停1秒或超0.5秒停1秒,总超声时间(不是总时间)在十分钟左右,另外,你用10ML离心管的话功率差不多200W就可以了,
以上均从网友的帖子中摘录