丁香实验_LOGO
登录
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

【资源】常用DNA去除方法比较

丁香园论坛

11633
FDA、SFDA对重组蛋白、vero细胞疫苗等生物制品的DNA残留均有严格要求,近年来包括大牌进口产品在内的狂犬疫苗DNA残留超标问题,引起了社会和业界的广泛关注。

为什么一个看似简单的问题,却给众多专业人员带来如此大的困扰?一方面是由于DNA超强的化学稳定性,另一方面是由于DNA其带有大量的电荷易与其他生物大分子结合从而产生聚集(吸附)、包裹作用而难以完全除去。

DNA的去除方法主要有层析、膜过滤、离心、沉淀、酶解等方法。这里对工业上应该最广泛和有效的离子交换层析、鱼精蛋白沉淀、酶解三类方法进行比较。

1. 离子交换层析

DNA带有大量的负电荷,可以被阴离子交换剂吸附而除去(或用阳离子交换剂负吸附)。离子交换层析在生物制品的生产中广泛使用,负载量大、成本低廉,尤其工艺中本身具有这些步骤的情况,不需单独增加去除DNA的步骤,通过控制吸附、洗脱条件,就能取得良好的去除DNA的效果。

其缺点是在DNA残留要求较高的情况下难以达到。原因在于,当目标产物与DNA带有同种电荷时,分离较为困难;而当目标产物与DNA带相反电荷时,两者会发生聚集和包裹现象,影响去除效果。

2. 鱼精蛋白沉淀

鱼精蛋白为碱性蛋白,带有大量的正电荷,能够与DNA结合生产沉淀,从而将DNA去除。该方法操作简便、迅速,能有效降低DNA 残留量。

其缺点主要有两个方面:一方面是与离子交换层析具有相同的缺点,在DNA残留要求较高的情况下难以达到;另一方面是需要使用大量的鱼精蛋白,容易造成鱼精蛋白残留。

3. 酶解

① DNase Ⅰ

DNase Ⅰ具有DNA酶活性而不具有RNA酶活性,主要用于RNA去除DNA,用于重组蛋白等去除DNA活性偏低,效果不理想。

② 非限制性核酸内切酶

直到非限制性核酸内切的出现,DNA残留这一问题才得到很好的解决。非限制性核酸内切酶的典型代表有默克公司的Benzonase和上海拜朗生物技术有限公司Biolonase。该类核酸内切酶能够降解各种形式DNA和RNA,对单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA的磷酸二酯键均具有很高的活性,产生5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸寡核苷酸,且对核酸没有序列要求。是目前最有效的DNA去除方法。

Biolonase是经蛋白质工程技术改造的源于Anabaena sp.非特异性核酸内切酶,产品质量达到同类进口产品水平,价格远低于进口产品,是去除DNA最有效、经济的方法。

Biolonase具有多种规格的产品,除满足于常规去除核酸的Biolonase(纯度≥90%)外,还有满足于特殊要求的超纯Biolonase(纯度≥99%),此外高活力Biolonase更是达到500U/μl以上,相当于同类进口产品的两倍以上,居世界领先水平。
提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序