【交流】MICROARRAY入门教材
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导言
MICROARRAY，是固定在固体基片上的大量DAN序列的微阵列，是许多复杂核酸样本中特定DNA序列定性和定量研究的有效工具。日益引起人们兴趣的MICROARRAY，已经用于基因作图、变异分析和基因表达的检测，并且，有希望成为科学研究和临床应用的标准工具。
从原理上和实践上，基因芯片都是已用于核酸定性、定量研究数十年的杂交方法（Southern blot[12]、Northern blot[13]、克隆杂交和点杂交[14]）的发展：标记样本，再与阵列杂交；杂交足够的时间后，适当地洗膜数次；然后，探针与固定在特定位置上的样本DNA互补杂交而显现杂交印迹。
用MICROARRAY做平行杂交研究的思想本身并不新鲜，排列在滤膜上的阵列已经被用了很多年[15-17]。然而，不同领域的技术进步已把那些相当笨拙的膜变成了今天更加实用、有效的平行基因分析的方法：首先，大规模的测序工程产生的信息使得DNA集合聚集在一起成为可能，而这些DNA相当于许多组织（从细菌到人）中的全部基因或大部分基因；其次，技术进步已经使得生产高密度DNA阵列成为可能，从而使成千上万个基因展现在比标准的载玻片还小的面积上；最后，核酸荧光标记和荧光检测的进步使得这些芯片的应用更加简便、安全和准确。
本综述旨在描述一种微阵列技术的最新用法，通常被称作“点片”或“印片”。之所以这样称呼是因为该方法是将通常的大于寡核苷酸（100bp以上）的DNA通过物理分配方法点在固体基片上，这与最近其它主流的微阵列技术（短的寡核苷酸被直接合成在固体支持物上[18，19]）方法不同。在标准的点片操作中，把DNA样本（PCR产物、质粒等）装在96或384孔板中，用一个配有一束特殊设计点样针的机械手伸入板中相邻的样本孔中，吸上大约１µl的DNA样液，分别点在处理过的载玻片上。通过交叉的方式，用适合96孔板的４根一束针头或384孔板的16根一束针头成功地将数千个DNA样本点在一个玻片面上。用束状点样针接触每张玻片表面，可同时成功点100-200张具有同样阵列的芯片。每点完一次后，要清洗、干燥点样针，然后再装载另几个DNA样液。点完所有的点阵之后要处理玻璃片，使得DNA固定在玻片表面，以最大限度地减少探针非特异性结合在芯片上。MICROARRAY已被用于很多不同的目的。通过MICROARRAY，数千个序列能立即被检测出来。这篇综述着重于基因芯片在基因表达研究中的应用以及在基因组表达检测中的应用原理，并详细描述了MICROARRAY的制作和使用过程。
基因表达的检测
基因表达检测的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、细胞的RNA的绝对表达量。可以先从样本中抽提RNA，再标记RNA，然后将这些标记物作探针与芯片杂交，就可得出原始样本中不同RNA的量。然而用于杂交的某个特定基因的RNA的量与在一个相应杂交反应中的信号强度之间的关系十分复杂，它取决于多种因素，包括标记方法、杂交条件、目的基因的特征和序列。所以芯片的方法最好用于检验两个或多个样本中的某种RNA的相对表达量。样本之间某个基因表达的差异性（包括表达的时间、空间特性及受干扰时的改变）是基因表达最重要的，而了解RNA的绝对表达丰度只为进一步的应用或多或少地起一些作用。
双色杂交：为了最大限度地增加差异显示的可靠性和精确性，我们用两种具有不同光谱的荧光染料标记两种不同样本，然后混合这两种探针，并同时与一张芯片杂交的方法来直接对比这两种样本。两样本中的一种基因的相对表达量可通过同源目的基因的两种染料的荧光强度的比值检测出来。这个比值对以上讨论的那些可能影响与某个特定基因杂交探针绝对量，但不影响两种标记探针杂交相对量的因素不敏感。
DNA基因表达谱芯片的应用范围：最简单的基因表达谱检测是比较两种不同细胞或组织样本中的与芯片阵列中相应基因对应的mRNA的相对丰度。例如，可对比试验干预前后，或经某种处理后连续时段内的细胞以及不同分化时期的细胞，也可以对比突变型和野生型之间的mRNA表达的不同方式。这种试验方法灵活，使研究者可以收集到有关每种基因表达调节的更准确信息。例如，通过一张芯片上的多核糖体RNA和总mRNA的对比杂交，可以测出每个基因的翻译效率；通过细胞核和细胞质中的polyA RNA样本的差异性杂交，可以估计出细胞核与细胞质中的每种polyA RNA的分布：同样的方法还可以调查其它类型的亚细胞单位。
I型和II型试验：许多受关注的生物学问题都能用双色杂交试验这种最简单的方法来研究。即两种样本直接在一张芯片上进行比较（被称为I型试验[20]）。然而，对于需要对比多个样本的复杂问题，这种直接的比较就不适用了。针对这种情况，我们使用一种替代的试验设计，即在每次杂交中加一个一般对照作参考，这样既保持了双色杂交内部对照的本质特征，又可形成在大量样本中的推断对比，而不需要每个成对样本单独对比（这样的试验设计为II型试验）。这种方法最普遍的应用是用于时段（time-course）试验[21]，即每个时点（timepoint）与一个原始时点作对比。由于在某个时点的一个特定基因的量相对于一个固定的参照（原始时点）而被检测，那么就可研究通过这个时段的每个基因的活动方式。参照物不一定与被检验的样本有关系，参照物最主要的属性是它应提供一个杂交信号，这样在芯片上任何一个目的基因的杂交信号比值的分母就不会为零。因为在被对比的大量样本中，一个理想的参照物对于每个样本来说，都是一样材料的混合，在这个混合物中，在一个样本中表达的任何一个基因，也会在参照物中表达出来。
仪器设备
制作和应用基因芯片，需要两种设备：一个是制作芯片的机械手（又称点样仪）和一个扫描芯片的装置，一般是一个激光共聚焦显微镜（或称扫描仪）。许多大的实验室和生物技术公司对基因芯片技术的冲动已被操作芯片试验所要求的较高专业技能和其惊人的价格所冲淡了。为了使该技术操作更方便，价格更可接受，我们设计了价格相对便宜，及对分子生物学家来说更易操作、不需要太多工程专业经验就能装配和操作的仪器。并且在网上（http://rana .stanford.edu/hardware）登载了详细的数据、设计结构和操作说明书。点样仪和扫描仪两项仪器总的价格大约是60000美金。
靶DNA的制备
靶DNA的选择：对于大规模基因表达的研究，每个被分析的基因都需要一个特定的杂交目标，从本质上讲，因为任何双链DNA样本（以及大部分单链DNA样本）都能被点在处理过的玻璃片上，所以点片用的靶DNA的选择很大程度上取决于所要研究的基因的可获得程度。对于那些基因组已被完全测序的有机体，最简单的方法是用PCR扩增基因组中已知的、预知的开放阅读框（或研究者感兴趣的子集）。寡核苷酸合成费用的不断降低（现在大约每对引物10美元）及96孔PCR仪的广泛应用使得这一方法十分可行，甚至对于相对大的基因组也适用。我们实验室已经用这种方法制作了来自于测序酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因组[22]大约6200个开放阅读框的芯片，其中含启动子和终止子。对那些基因组未测序或部分测序的，或者是基因组带有大量内含子的生物体，这种方法不适合。对于很多生物体，如人和小鼠，目前常用来自cDNA文库的带有特异性序列的克隆，以及ESTs来鉴定不同mRNA的转录物[23]，而与这些转录物相应的单个cDNA克隆就可以作为靶DNA用于点芯片。我们实验室最近已用这种方法制作了约10000个基因的人类基因芯片，点在芯片上的DNA序列是用PCR扩增的cDNA克隆（I.M.A.G.E. cDNA文库）[24]的插入片段。对于那些没启动基因组测序计划的或还没得到序列的有机体，来自cDNA文库的克隆（相当正规的实验室能最大限度地减少重复）也能作为点片的靶DNA。在预先没有关于序列、基因图位点和基因序列数据库编号的任何信息的情况下，也能收集到每个克隆的表达数据。
人们会发现，用小的DNA片段来代表每个基因要比用全长开放阅读框或1000bp cDNA更有益。例如，在相互之间有显著同源性的酵母基因中，用代表序列差异最大部分的PCR产物代替整个编码区，可增加两基因之间的鉴别力，每个基因理想的表达量是目前研究的一个复杂问题。
PCR扩增：一般来说，一个100µl的PCR反应所提供的DNA足可以点1000张芯片，我们大多数的100µl反应体系都是在96孔PCR仪(Perkin Elmer 9600s and9700s)中完成的。扩增的实验参数取决于所用的模板和引物的类型，然而限定PCR的模板、引物、dNTP、镁离子、标准缓冲液和酶是十分重要的。一般附加剂如甘油或明胶因改变表面张力或竞争玻片表面的附着位点而影响点片过程，应避免使用。
点样DNA的制备：为了纯化PCR产物以制备点样DNA，我们一般用异丙醇沉淀PCR产物，然后在3× SSC中以大约100 ng/µl的浓度重新悬浮DNA。沉淀既能在PCR孔板中又能在V型底96孔组织培养板中进行。首先在每孔中加入10µl 醋酸铵（3M，ph5.2）；再加110µl异丙醇（我们用异丙醇而不用乙醇，使得沉淀混合物的总体积减少到能与PCR孔板或组织培养板容积相适应）；置孔板于-20℃，1小时（如果时间不允许，这一步可省略）；4℃下，3500×g（或3500rpm）离心沉淀1小时；在孔板下放2-3层纸巾以防破碎。在一个离心机转头接头上可以叠放4块V底孔板一起旋转，在每块孔板之间放一个纸垫，然后把孔板小心地捆在一起，以防滑落。沉淀后，吸出或颠倒孔板来弃去液体。用100µl 70%乙醇（用95%乙醇配制，因为100%乙醇中可能含有荧光杂质）洗沉淀，再离心30分钟，吸去或轻轻倒出液体，在体积适合96孔板的抽干机中浓缩干燥沉淀，（我们用Savant Speed Vac Plus SC210A；如果没有该仪器可在空气中干燥沉淀，但要防止灰尘）。在10-15µl 3×SSC（ph7.0）中重悬沉淀，4℃下至少放置12小时，小心封好孔板，以免蒸发。因为过多的盐及DNA的浓缩会影响点片。重新悬浮后，把溶液转移到软板中（Fisher3911Micro Test III Fexible Assay Plates） 备用点片。封严孔板，储存于4℃或-20℃直到使用。在点片前，将孔板轻轻地离心一下，以保证所有物质都集中于孔底。
有些用户在用这种沉淀程序时，很难得到前后一致的结果。有很多从PCR反应中回收纯化DNA的附加方法，也能买到大量纯化PCR反应的试剂盒。我们没有对点片中的这种方法做过广泛的调查。这一步骤主要目的是尽可能减少对DNA终溶液的污染，盐、清洁剂、甘油、明胶和一些特定的粒子如过柱树脂等会影响后续很多点片步骤。如果操作这一步，必须十分小心，以确保去除DNA终溶液中的杂质。任何其他点片用的DNA溶液制备的替代方法都应先做小规模的试验，并且用于整个点片和杂交过程以确保合适。下面介绍已被成功使用的一种候选方法。
聚丙烯酰胺葡聚糖纯化法：这种方法的原理是用一个简单的凝胶过滤树脂，保留盐离子和其它一些小的分子，而排出PCR产物。因为DNA在水中洗脱而被排出，这样就不需要沉淀过程了。同上所述，操作时必须十分谨慎，以防树脂污染点片溶液。要纯化100µlPCR反应物，准备聚丙烯酰胺葡聚糖S400树脂（Sigma S400 HR）并以2:1的比例用ddH2O稀释。以100µl每等份分装到96孔滤板中（Polytiltronics UN800-PSC/mepp/D）。向板中加400µl ddH2O洗４次，用真空排枪(Vacuum Manifold)(Polyfiltronics UNIVAES)吸出液体，把这个滤板套入聚丙烯96孔板中，４℃，2000rpm （Ｂackman GS-6离心机，带有Ｇ.Ｈ.3.8转头和Ｂackman Microplus carriers）离心５分钟，弃去所有残留液体。加100µl双蒸水（ddH2O）如上方法离心。加100µlPCR产物混匀，倒入一个干净孔板中，在抽干机中干燥。最终用３×SSC重新溶解PCR纯化产物。
玻片的准备
我们的微阵列绝大多数是点在用左旋多聚赖氨酸（poly-L-lysine）修饰处理的载玻片上的。我们尝试过许多备选的修饰物，包括多种硅烷，但没有一个像poly-L-lysine这样简便而可靠。为了准备左旋多聚赖氨酸修饰的玻片，把准备的载玻片（Gold Seal 产品，目录号是3010）放在金属或玻璃架上（从Wheaton可以购到各种型号的架子），使玻片垂直固定，把架子放在一个合适型号的玻璃缸内。一定要使用玻片架，架子要放在低速离心机中，到此步结束时它们要被旋转干燥。最好避免把玻片从一种类型的架子上转移到另一种上。虽然大多数玻片盒上都标有“干净”，但处理玻片前再清洗是必要的。用50g NaOH溶解于200ml ddH2O，再加300ml 95%的乙醇（不要用100％乙醇）制备500ml碱性洗液，把玻片完全浸没在洗液中至少２小时，洗完用ddH2O全面冲洗５次，摇５分钟冲洗。保持玻片浸没在ddH2O中，一旦洗净玻片，它们暴露于空气中的时间越短越好，因为灰尘会影响修饰和点片的过程。准备修饰溶液（350ml），包含35ml poly-L-lysine（0.1％Ｗ／Ｖ溶于水，Sigma P8920）, 35ml灭菌过滤PBS和280ml ddH2O，把该溶液倒入一个干净的玻璃缸中快速把玻片从最后一次洗液中移到修饰溶液中。轻轻摇动溶液１小时，把修饰处理过的玻片插进一个装有干净ddH2O的缸中，上下抽动５次，把这个玻片架转移到一个低速离心机中（在架下放纸巾吸液体），旋转使玻片干燥（５分钟，室温下，1000rpm, Beckman Gs-6离心机，带有G.H.3.8.转子和Beckman Microplus carriers）。用铝箔包裹干燥的玻片，防止灰尘。把包好的玻片架放进一个真空干燥炉中，45℃，10分钟，真空干燥。把玻片从铝箔中取出放进一个干净的塑料玻片架上（木头和软木塞有可能会使玻片上粘上粒子，最好不用），用封紧的玻片盒室温贮存。这些玻片不能马上用于点片，必须被固化（或风化）至少数周，使其表面充分疏水干燥（玻片一般在修饰处理一个月后用于点片），修饰处理后的玻片表面的疏水性对于保证DNA样点足够小以形成高密度阵列是十分重要的。一批玻片准备就绪，就要作抽样质检，方法是取出一张玻片，在其表面放150µl H2O, 把玻片与水平呈45度角，观察水滴在玻片表面滑落，如果留下明显的滑落轨迹，就说明该玻片已经可以使用。然而，检验玻片是否能用于点片,唯一最可靠的方法是在这一批玻片中先点几张作实验（见点片一节）。
点DNA微阵列
用于点DNA微阵列的机械手是标准的“取--放”式机械手的改进。在标准点片操作中，一大批载玻片被固定在一个平台上，溶于３×SSC的DNA样本放置于96或384孔板中，此板放在一个支持物上，机械手上有一束专用的弹性载样点片针，机械手将这些点片针伸入相邻的装有DNA样品的孔中，大约每根针吸装１µl DNA样品溶液。然后这些点样针在多个Poly-lysine处理过的玻片上特定位置点一小滴DNA（<0.5nl）,在每张玻片上点完DNA后，要清洗和烘干点样针，然后吸取下一批DNA样本，并在距上一次点片点很小距离的新位置重复此过程，从而形成高密度的点阵（阵列）。点间距取决于所点DNA液滴的大小，而液滴的大小又取决于点片针的特点和锐利程度以及poly-L-lysine表面的疏水程度。我们常规是用样点圆心间距约200µm的距离来点片，也可以将此距离缩小到近100µm。在200µm的距离下，整个酵母基因组能点于一张1.8cm2的玻片上，而在100µm的距离下，大约75000个人的基因能点于一个标准的１×３显微镜玻片上。我们现在的机械手大约用２分钟完成每个循环（洗针、烘干、载样、同时点110张玻片）。我们使用４个针为一束的点样头，针与针之间的距离正适合标准96孔微孔板的临近孔距。这样其点片的效率是110张片子每小时120点。只要在机械手技术上稍作改进，就可以把一个循环的时间缩短到一半。我们已经在384孔板以每16根针为一束的点样针进行点样，这种配置可达到在每110张上，每小时约点1000点的效率，或６小时点完酵母整个基因组。扩增到32个针（２倍面积）将能在110张片子上把整套人类基因在２天内点完。
点片针：作为机械手上与DNA和玻片接触的唯一部分，点片针是制作基因芯片最关键的构成。我们用的点片针（见图2）在原理上与鹅毛笔相同，通过毛细作用，把液体吸起，当点片针与玻片表面接触时，再把液体点下。针的制作是先在一个不锈钢圆柱的中间挖一个槽，圆柱的一端被削成圆锥体状，其中间的槽直通尖部。针尖中槽的两侧是紧贴在一起的，当它接触玻片时两侧才分开，使样液流出。针尖可用手工进一步削尖。当针尖浸入DNA溶液中时，液体被吸入载样槽中。当针尖轻轻点在玻璃上时，DNA只在这一点流出。在点片过程中，很多其它因素会影响点的大小（玻片的疏水程度，房间的湿度），一般来说，越尖的针头，点出的点越小，所以针头必须尽量保持尖锐。因为我们的点片针是用半手工方式制作，所以他们的表现并不完全一致。此外，尽管高质量的针尖可使用数10万次而无明显损坏，但针尖仍需要保养。所以制作一张好的芯片，保持针尖的高质量是最重要的一步。把针尖浸入一个超声波清洗器sonicator（Branson 3200）中漂浮来清洗针尖，再把针尖浸入清水中，把针尖浸入３×SSC中来灌洗针尖，使液体吸入载样槽中。选择一套装置，放在点片机前，通过试验点片来检测针尖的质量。试验点片的过程是只把一张玻片放在平台上，把针尖浸在新鲜的试验溶液中（包含溶于３×SSC的100ng/µl的鲑鱼精DNA），以点中心之间最适合点片的距离在一张芯片上点几百次（机械手的软件配有做这种试验点片的各种选择距离的程序）。试验点片后，再检验玻片。点片用的DNA溶液含盐量高，容易看清每一点大小、形状（见图3）。仔细检验玻片确保：１.每个针尖都把DNA样液点在了玻片上，至少在数目上是一样的；２.同一张片上，点的大小和形状大致相同；３.所有针尖所点的样点大小、形状大致相同。如果不能点出样液，原因既可以是载装DNA失败，也可能是点片时滴出DNA失败。首先要确保针尖点触到玻璃；其次确保针尖装载上了DNA，这可以通过把针尖移开支架，慢慢地把它浸入鲑鱼精试验溶液中（如前所述），吸起液体到灯光下，看是否液体被吸入载样槽中，如果针尖没有载样，是否DNA溶样不够粘稠（如果此溶液配制正确并新鲜,应和上述的靶DNA一样粘稠），然后，继续用超声波清洗法或用一个薄（<100µm）的不锈钢片来清洗载样槽。如果针尖已经载样，但仍不能点样液，很可能是针尖堵塞。取下针尖，拆开检查，可用超声波清洗法或轻轻地用一个薄片插入针尖来清洗。注意不要损坏针尖，针尖的两端不能相互接触，否则会阻止DNA滴出。
如果点太大或邻近的几个点融合在一起，可能是针尖不够尖锐或点玻片时用力太大。首先降低点片的冲力，然后拆下针尖用细砂纸和磨石磨锐针尖。点过大也可由于玻片疏水程度不够或表面活性剂污染DNA溶液。从审美角度上来讲，样点的大小应该一致，但只要能保证点够大而独立，点的大小、形状差异并不是一个严重问题。这种状态下的玻片至少可在1个月内保持稳定。
如果试验点片的一切情况均好，试验点片过程也要至少重复一次，然后马上开始正式点片，点片过程一旦开始，所要做的只是往点样仪中更换微孔板和检测点样质量。只要点样过程运行良好而恒定，则尽量不要中断点片过程。在点片时，微孔板是开放的，很容易蒸发（这样会改变样液的粘度而影响点片），因此，在一个大平台上一次加多个微孔板的设计是不明智的除非有能在点片前迅速开盖和制冷的微孔板，以最大限度减少蒸发。
在点样过程中，要密切检测样液是否持续点出及每点的大小、形状是否适当（注意：常常是前几张玻片所点出的DNA太多，如果芯片仍能看得过去，就不要停止点片过程）。最常见的问题是针尖堵塞而停止点样。如果发生这种情况，应立即中断点样过程，用上述方法清洗堵塞的针尖。针尖恢复正常，继续开始点样。另一个问题是灰尘或纤维塞进针尖而改变点的形状。这也需要清洗针尖。如果在点片时，针尖变钝会引起另一个不同的问题，即点太大，相邻点融叠，这可通过换针尖和磨锐针尖得以解决。
点片完成后，点阵的区域应用某种方式划出轮廓，因为洗脱盐份后，肉眼就看不见点阵了。我们一般用带钻石尖的刻板笔划出点阵区的边界线。必须用这种刻板笔来标记玻片，因为其它笔（如钢笔）所作的标记会在处理过程中被洗掉。然后把标记完的玻片从平台上取出，放在一个干燥的玻片盒中，贮存在凉爽干燥的地方。如果不需立即作后处理，这种状态下的玻片至少可以在1个月内保持稳定.
玻片的后处理
点样后微阵列用于杂交前需要四个步骤的处理：再次水合化和快速干燥、UV交联、封闭、变性。
再次水合化：点样过程一般不会将样点的DNA在该点均匀分布，为了使DNA在样点的各处均匀分布，需将在点样过程中很快干燥的各点再次水合化并快速干燥。这是一个精密过程，因为再次水合不充足将导致各点大小不规则，并降低总体杂交信号，而过分水合会导致点与点溶合。将标准台式加热装置(VWR Scientific Products H2025-1)的金属板翻转过来，这样可以产生一个平整金属表面。将加热板升温至80°C，在一个用塑料制成的玻片水合舱(Sigma H6644)的水池中装入热水(约50－60°C)，将每张玻片的点样面接近水面，让水蒸气水合各基因点，直至可以看到所有点出现折射光(一般需5－15秒)，立即将玻片放在加热板上，点样面朝上，直至干燥(一般需5秒)。这种处理需要实践技巧。尽管每批水合所需时间不同，甚至同张玻片上各点所需时间变化很大，但用温控水浴装置进行水合，仍会得到一致性更好的结果。有一些研究小组偏爱在低温下水合较长时间。我们的实验室没有试用过这种方法，但低温条件有可能降低这种过程的温度敏感性。
UV交联：玻片经再次水合化和快速干燥后，可用紫外线照射使DNA交联到玻片上。虽然不是关键步骤，这一处理可增加各点上稳定固定、可杂交DNA的量，尤其是点样液中DNA浓度较低时。将玻片以点样面朝上放在交联仪(Strategene UV 1800 Stratalinker)的塑面上，将时间模式转换至总能量模式，照射能量为60mJ(按Stratalinker说明操作)。
封闭：是后处理中最关键步骤。剩余自由赖氨酸经修饰后可以降低和标记探针DNA结合力。如果这些基团不被封闭，标记探针就会非特异地结合到玻片表面，并产生极高背景。我们用succinic anhydride (Aldrich 23，969-0)进行酰化封闭。赖氨酸带电氨基对一个羧基碳原子进行亲核攻击，从而形成一个胺键并在分子链的另一端暴露一个自由羧基负电基团。除了将赖氨酸氨基基团转换成胺，这一新生物还有一个带负电的表面，从而可以进一步降低非特异结合DNA。
因为液相中封闭试剂的稳定性有限，封闭过程应快速是重要的。找一个玻璃缸，一个带柄的玻片槽，该槽应容易放进缸中。将玻片放入槽中，再将槽放入通风橱中，紧邻着玻璃缸。我们用的缸中盛有350ml溶液，按此比例放大至你所需要的体积以完全浸没玻片。取335ml水倒入一个500ml玻璃烧杯中。用记号笔在烧杯外壁标记液面位置，将水倒掉，并用95%乙醇冲洗烧杯，用纸巾小心拭干，放入一个磁力搅拌棒。将烧杯放在通风橱里的磁力搅拌器上。取15ml Sodium Borate (1M，pH8.0)放在烧杯边上待用。称6克 Succinic Anhydride放入烧杯，迅速倒入1，2-methyl pyrrolidinone (Sigma M6762)至335ml标记线，高速搅拌(该溶液此时应显澄清，尽管在封闭反应中略显黄色；如果一开始就显黄色，说明溶解物已经变质，不要再使用)。Succinic Anhydride溶解后，立即加入Sodium Borate搅拌至溶液混匀(约5秒)，将溶液倒入玻璃缸中，迅速将玻片槽浸入液面下，并上下晃动玻片5次。将玻片槽封口(玻璃盖或铝箔)，轻柔摇晃玻片槽15分钟。
变性：在封闭反应进行时或在这之前，准备一个大烧杯或玻璃缸(要足够大以容得下封闭步骤中的玻片槽)，装入一些沸水，体积应至少是封闭液的两倍。封闭反应即将结束前，停止加热，待水不再沸腾时，迅速将玻片放入水中，上下提拉晃动3-5次并让玻片坐浴2分钟。将玻片立即放入装有95%乙醇的玻璃缸(再次提醒，不要用加水稀释100%乙醇配制而成的95%乙醇)。上下提拉玻片槽3-5次，将玻片放入离心机，甩干。经过以上处理的玻片就可以用于杂交了。
制备探针
分离RNA：我们成功尝试了各种方法制备的RNA，包括热酚抽提、异硫氰酸胍稳定及其它方法等，这些方法已在别处综述过，就不在此赘述了。我们也成功尝试了Invitrogen的FastTrak 2.0 mRNA isolation kits (Invitrogen K1593-02)，用于抽提人和酵母的样品。主要判定指标为产出高质量的RNA。对基因表达研究来说，最好的结果是用poly-dA RNA作为逆转录模板，尽管，至少对酵母菌来说，用总RNA作为逆转录模板也取得了好结果。一个好实验对每种标本需要至少1µg(越多越好)polyA RNA(或100µg总RNA)以用作合成荧光标记cDNA探针的模板。扩增小量RNA的方法正在尝试之中， 与在这讨论的方法进行比较。
标记：已有许多方法用于从RNA制备标记探针。在多数情况下，我们直接在oligo-dT为引物进行逆转录反应时标记cDNA。在某些条件下，用随机引物进行cDNA合成也可用于标记，尽管此方法不是对所有微阵列设计都适用。例如，由3’端序列组成的微阵列更适用于oligo-dT反转录的cDNA探针，由完整cDNA序列或含预测开放阅读框架序列构成的微阵列对两种逆转录方法都适用。样品还可在未标记的第一链合成后进行第二链合成时再标记。以下列出三种方法。
荧光染料：很多荧光染料标记的双脱氧核苷酸可由商业渠道取得。出色的结果是用Cy3-和Cy5-dUTP获得，两者激发光谱分得很开，用多种酶均可获得特异活性掺入，干燥后就可激发荧光，从而简化了图象获取过程。我们取得良好结果的其它荧光染料包括R110 (Perkin Elmer)、TAMRA (Perkin Elmer)和SpectrumOrange(Vysis)。
oligo-dT和随机引物逆转录标记：所有试剂应经过灭菌及DEPC处理。RNA溶于10µl水中，该溶液应包括一些对照RNA(参见本文后半部分)。加2.5µl(6µg)引物(20-mer oligo-dT，anchored oligo-dT，random hexamer或random nonamer：2.5µg/µl，用水配制)。70°C水浴10分钟以变性RNA，放于冰上。将下列试剂混合：2µl MMLV逆转录酶(GibcoBRL SuperScriptII Rnase H- Reverse Transcriptase kit; 目录号 18064-014)，6µl 5×first-strand buffer (SuperScript kit; 250mM Tris-HCl， pH 8.3， 375 mM KCl， 15 mM MgCl2)， 3µl 0.1 M DTT(也在试剂盒中)， 6µl 5×nucleotides (2.5 mM dATP，2.5 mM dCTP，2.5 mM dGTP，1.0 mM dTTP)，3µl 1mM Cy3或Cy5标记的dUTPs (Amersham)。上述混合液加入RNA-引物溶液，终体积为30µl，42°C保温1小时。加入1µl SuperScript II逆转录酶，42°C再保温1小时。加1.5µl 20mM EDTA以终止反应，加入15µl 0.1M NaOH降解模板RNA，70°C孵育10分钟，立即加入15µl 0.1M HCL以中和样品(荧光染料，尤其是Cy5对高PH敏感)。将样品放入Microcon30微浓缩器(Amicon)，并加入500µl TE (10 mM Tris，pH 8.0，1 mM EDTA)，在台式离心机上高速离心5-10分钟，以调整体积至10-20µl，弃流出液，加500µl TE，再次离心。二次离心后，Microcon滞存的探针应显著比流出液清亮。这一个成功标记反应的非常有力的指示现象。如果没有一点颜色滞存，标记反应就不太可能产生好的染交结果。将离心柱反转，再离心1分钟，以收集探针，将Cy3、Cy5标记的探针混合，并TE调整体积至500µl，用离心柱调整体积至8µl(到此，颜色应显紫色)。加2µl封闭液，封闭液含10g/µl 20-mer oligo-dA，10µg /µl yeast tRNA以及10µg/µl human cot-1 DNA (用于人探针时，GibcoBRL目录号15279-011)。加入2.1µl 20×SSC(终浓度为3.5×)和0.4µl 10%SDS(终浓度为0.3%)。注意加SDS时，枪头外壁不应有SDS，因为过多SDS会对杂交反应产生负影响。将样品放入100°C水浴1分钟，以变性样品。该样品应在实验台上自然冷却。对人样品，应在室温下放置30分钟，以允许cot-1酶切DNA片段与重复序列杂交，对酵母样品来说，样品一旦冷却下来即可用于杂交反应了。对杂交面积为2cm×2cm的阵列来说，杂交液体积适宜用12µl，杂交面积越大，也就需要更大体积的杂交液。
用Klenow酶标记cDNA：用以上方法制备cDNA模板，唯一例外之处是5×核苷酸溶液中的每种dNTP浓度为2.5mM(即逆转录反应中每种dNTP的终浓度均为0.5mM)，不含荧光染料标记的核苷酸。按前述方法调节样品至终体积20µl，加入3µl随机引物(hexamer或nonamer，4µg/µl)，100°C变性1分钟，置实验台上冷却5分钟。加入5µl 10× buffer (100mM Tris-HCl， pH 7.4， 50 mM MgCl2， 75 mM DTT)， 5µl 10× nucleotides (0.25 mM dATP，0.25 mM dCTP，0.25 mM cGTP，0.09 mM dTTP)，1.5µl 1mM Cy3或Cy5 dUTP(Amersham)，2µl(10U)无外切酶活性的Klenow酶(USB，目录号E700572)，13.5µl ddH2O至终体积50µl。37°C温育4小时。按前述方法纯化样品并准备杂交。
杂交
用台式离心机将探针样品高速离心1分钟，以沉淀任何可能的杂质。用移液枪将样品吸加到阵列中央，注意不要碰到离心管中任何沉淀并避免形成气泡。封盖玻片(要足够大以覆盖整个阵列杂交区表面)，注意不要形成气泡。在该玻片的另一区域滴加5µl 3×SSC，以提供杂交舱内湿度，由此可以确保杂交过程中探针混合物不会蒸干。将玻片放入封口的杂交舱中，并浸入65°C水浴，4-6小时。
杂交后处理
杂交后，小心擦干杂交舱并移出玻片，浸入盛有洗液1(2×SSC，0.1%SDS)的玻片槽中，玻片点样面朝下，这样当盖玻片掉落时不会划伤阵列表面。剥落盖玻片后，将玻片在洗液中晃动2-3次后移入盛有洗液2(1×SSC)的玻片槽中，小心操作，尽可能减少洗液1混入玻片槽2中，因为SDS会干扰玻片图象质量。轻柔摇晃玻片槽2分钟，将玻片移入盛有洗液3(0.2×SSC)2分钟，然后离心甩干玻片。所有洗液温度均应为室温。改变这些步骤的温度和时间会改变杂交的严谨性。
参照
由于微阵列试验的高平行性，所以在每张阵列反应中加入多种参照物是可能的而且是很有价值的。下面将描述一些有用的参照。
掺入RNA：在探针制备过程的各个阶段加入已知量的参照RNA，对检测和评价每次实验的各个方面是非常有用的。很明显，选用的掺入RNA不应与待研究的有机体的RNA有交叉杂交，但两者总体特性应相近(GC含量、长度、poly-A尾巴)。许多酵母菌基因可以在人基因表达阵列上用作参照，因为两者在核苷酸水平的同源性很有限。将上百个这样的基因点于人的基因阵列上只是显著增加了点样时间。将这些基因克隆到带有噬菌体RNA聚合酶结合位点和人造poly-A尾巴的质粒上，就可以制备用于各个实验阶段的参照基因的大量RNA。此类参照可用于各个方面，例如，参照RNA可以按不同比例或以不同总浓度掺入Cy3、Cy5标记反应，由此可以测定杂交严谨性、输入比和输出比的校正以及检测灵敏度。
RNA质量参照：某一类型核酸与互补靶基因结合的量与互补序列长度有关。所以某一给定cDNA的杂交信号强度随RNA质量好坏而不同。这会导致不能理解的微阵列杂交结果，例如，用不同质量的同一RNA衍生得到的等量cDNA用于杂交时，会看到ratio值明显不相同。谨慎选择靶基因序列可使这个问题的影响最小化。对oligo-dT逆转录的cDNA，如果靶基因序列局限在3’端，则对RNA质量最不敏感。RNA质量可由相应参照物方便地检测，例如叠瓦式覆盖整个基因的长度为100-200bp的一组DNA片段可以用于测定待比较样品中的RNA相对质量，而降解RNA及由oligo-dT逆转录标记的cDNA于5’序列含量较多的基因杂交会产生相应比例的弱信号。制备叠瓦式基因片段作为参照，在RNA和探针制备的各个阶段掺入进去，例如，收获细胞时、分离poly-A RNA时、探针标记时以及杂交前，由此可以鉴定设计RNA质量问题的实验步骤。
封闭参照：如前所述，由于探针和靶基因之间存在非基因特异性的相似性，尤其是由重复序列引致的，大多数杂交反应需加入冷DNA进行封闭。与此类潜在的混淆序列相应的参照靶基因可用于检测封闭是否成功。例如，如果重复序列被成功封闭，在人类基因表达阵列上含有人cot-1酶切DNA片段的基因点应产生极弱或甚至阴性信号。其它有用的阴性参照包括oligo-dA、oligo-dT、质粒DNA和人基因组DNA。
归一化参照：对多个样品来说，很难准确制备完全等量的参照mRNA标记探针，所以加入一些预期在相互比较的2个样品中的杂交信号一致的参照基因是非常有用的。例如，对酵母菌表达实验来说，酵母菌总基因组DNA制备的靶基因可用于校正两样品间的信号，而人基因表达实验的校正更复杂，由于只有一小部分基因组是表达的，人总基因组DNA杂交信号应该非常低。
扫描玻片和数据处理
杂交后应获取针对实验所用2种荧光染料的微阵列荧光图像。我们使用的装置是激光扫描共聚焦显微镜(扫描仪)。扫描仪有一个激光管(或一组激光管)，可以产生与所用荧光染料激发光谱相应的某一波长激光。激光穿过一标准物镜照亮玻片上的一个点，激发荧光被物镜聚集后又穿过一系列滤镜(以去除激发光波)、一个校准透镜和一个极小孔眼(以降低噪音，这使得它成为一个共聚焦装置)，并在一个光电倍增管中进行计量。激光束快速扫描玻片后获得微阵列的一幅光栅图像。用一对galvanometer将光束定位于固定玻片上的各个点，或用泛光照射源和CCD镜头，也可获得相似图像。我们发现共聚焦扫描装置所获结果最好，因为其信噪比优于galvanometer或CCD。
如前所述，实验最终目标是测定玻片上每一点的两种荧光染料的相对信号值。有多种方法可以完成这一任务，最常见者是将图像栅格化，然后计算每方格中每种荧光染料的平均荧光强度，两样品中基因相对含量就变成了两种荧光信号强度的比值。这种计算可能会受诸如对大多数阵列可见到的非零荧光背景进行补偿计算的影响。我们开发了相应软件，可运用多种算法准确估算背景值，并用更复杂的算法直接测定相对荧光强度比值。这个会和计划中的价格不贵的共聚焦扫描仪一起面市。
点样问题
用到DAN微阵列的实验会在任一步骤中遇到技术问题，而由微阵列提供的加入多种内参照方法将有助于识别和校正许多问题。确实，甚至有严重瑕疵的实验也常提供足够多的有用新信息。明智的实验设计是，只要有可能，就应安排实验的每一步骤都能重复而无需重复整个实验，例如多准备些mRNA和玻片阵列，应多于实际需要量，这就是聪明之举。
十全十美的阵列图像是罕见的。我们碰到的许多问题很难追踪原因，而且在阵列扫描之前无法用可检测手段证明这些原因。我们建议在杂交珍贵样品前设立多级质量控制。成批的左旋多聚赖氨酸修饰玻片应加以质检，可取小量修饰好的玻片进行点样并测试整个后处理和杂交过程。只有小量玻片测试成功，同一批次的大量玻片才用于真正的点样。一旦玻片点样后，应对小量点样玻片进行后处理，后处理是否成功可用已知应产生良好结果的RNA制备的探针进行测试来判定。最后，所有阵列在杂交前应扫描一次，弃去那些有明显污点的玻片(划伤或任何影响左旋多聚赖氨酸修饰的因素均可被检测为微阵列上的背景荧光)，并弃去那些杂交前背景就高的阵列。左旋多聚赖氨酸和其它修饰物在对应于Cy3波长激发光下会发弱荧光，由于一些未知原因这种荧光在玻片之间有变异，偶尔强度达到能干扰杂交信号。另外，样点上的DNA在此激发波长下也会发出弱荧光且在玻片之间有变异。如果这些杂交前荧光信号源中的任一种的强度处于或接近杂交玻片上的信号，就应弃去这些阵列。以下讨论最常见问题(见图5)中的某一些。
样点的形状问题：一个常见问题就是部分或所有点有“彗星尾”，任一点的拖尾与其它点的拖尾方向一致，样点的颜色也反映在拖尾中。这一现象可能由于没有完全而快速地将玻片浸没在Succinic Anhydride封闭液中所致。使从样点洗脱的DNA又结合到玻片上。若拖尾的样点彼此是分离的，这些有彗星尾的玻片依然是可用的。与样点总体外观有关的另一现象是“面包圈孔”。按前述方法用点样针点样时，它并不是留下一个均一的圆，较多物质滞聚在样点的外围部分，就使得中央部分相对空当。这一现象可由延长再次水合化时间来解决。再次水合化时间再次延长些，那么彗星尾、面包圈孔就不会让一张玻片浪费，实际上只是稍稍在数据质量上作了一点妥协。
高背景：由于异常的高荧光背景而导致的芯片模糊是常见的问题。高背景即可出现在整个芯片的杂交表面，也可出现在一个局部区域。我们可以估计高背景的可能来源，但要确切地查明某种高背景的来源是困难的。在试图判断高背景问题时，弄清高背景在玻片上的位置是十分重要的。如果在杂交前预先系统地扫描芯片，覆盖整个芯片的明显高背景是可以避免的。高背景局限于杂交区，说明标记的探针粘着于玻片表面，在洗片步骤时没有被冲洗掉，导致这一结果有两种可能性，一是poly-lysine的氨基基团封闭不足，或是在杂交中标记的探针非特异吸附。这种来源的高背景通常伴随着“anti-probe”现象，此高背景只出现在非样点区域，这很可能反映出这一区域的poly-lysine容纳点片DNA能力降低。在某种情况下，芯片的一边背景较差，提示与玻片在液体媒介（最可能是封闭液）中被如何放置有关。通常高背景易出现在盖玻片的边缘，可能提示探针在杂交中脱水析出，这一问题可通过在杂交舱中加多点3× SSC，并确保封好杂交舱而得以解决。均一的高背景也可能是由于探针制备不好导致，因为小的探针片段或不合格的荧光核苷结合在表面引起高背景却不影响杂交信号。
局部信号微弱：大部分高背景现象都伴随特异性信号减弱，因为探针的信号被芯片表面的高背景所掩盖。然而，不伴有高背景的信号微弱也可能发生，经验认为这是因为这一区域探针层太薄而引起的。芯片或／和盖玻片表面的气泡和不匀质也能引起这种结果。仔细选择和放置玻片与盖玻片可减少这个问题。
结论
MICROARRAY是在基因组范畴内进行探索、研究的有力工具。多年来生物学家已经能研究少量条件下的大量基因或多种条件下少量基因的差异表达。基因芯片第一次使上千种条件下研究成千上万个基因成为可能。对于那些基因组序列已知的生物体（如Saccharomyces Cerevisiae）这一技术使同时研究其所有基因表达成为可能。对于人类，应用同样方法的唯一局限性就是需要已知基因的数据；人类完整的转录物鉴定和测序将在以后几年完成。过去，由于实验工具的局限迫使大部分基因表达类型的设计仅徘徊于某种假设，和被限定于我们有限知识的基础上。而现在我们可以设计实验去系统地探索生物学广大的未知领域。作为研究工具的MICROARRAY的实用性就在于它的灵活简便及价格低廉。所以在我们研发这项技术的种种可能的改变时，注重它的研究目标、简便性和低廉性，在我们改进这项技术时，应本着尽可能降低它在经济、使用和心理方面障碍的原则，以使一个独立的实验室在一年内就能完成基因组范围内成千上万个基因研究。
拥有点样机、扫描仪的独立实验室可以在一年内进行某种条件下成百万个不同基因的表达或其特征的检测。这一史无前例的收集大量基因表达信息的技术发展速度惊人，以至于出版、分发、保存的机制和相应标准的建立速度尚无法赶上研究所产生结果的速度；另外整理、观察、解释大量信息的分析软件仍处于发展的初级阶段。但这不会成为基因表达和其他功能研究的阻碍，这一新的前沿技术给生物领域的开拓者展现出了新的挑战机遇。
参考文献
1)J. DeRisi, L. Penland, P. O. Brown, M. L. Bittner, P. S. Meltzer, M. Ray, Y. Chen, Y.Su and J. M. Trent, Nat Genet, 14, 457-60 (1996).
2)M. Chee, R. Yang, E. Hubbell, A. Berno, X. C. Huang, D. Stern, J. Winkler, D. J.Lockhart, M. S. Morris and S. P. Fodor, Science, 274, 610-4 (1996)
3). L. DeRisi, V. R. Iyer and P. O. Brown, Science, 278, 680-6 (1997).
4)F. Forozan, R. Karhu, J. Kononen, A. Kallioniemi and O. P. Kallioniemi, Trends Genet,13, 405-9 (1997).
5)R. A. Heller, M. Schena, A. Chai, D. Shalon, T. Bedilion, J. Gilmore, D. E. Woolley and R. W. Davis, Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 2150-5 (1997).
6)D. A. Lashkari, J. L. DeRisi, J. H. McCusker, A. F. Namath, C. Gentile, S. Y. Hwang, P. O. Brown and R. W. Davis, Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 13057-62 (1997).
7)L. Wodicka, H. Dong, M. Mittmann, M. H. Ho and D. J. Lockhart, Nat Biotechnol, 15, 1359-67 (1997).
8)M. Schena, D. Shalon, R. Heller, A. Chai, P. O. Brown and R. W. Davis, Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 10614-9 (1996).
9)M. Schena, D. Shalon, R. W. Davis and P. O. Brown, Science, 270, 467-70 (1995).
10)R. J. Lipshutz, D. Morris, M. Chee, E. Hubbell, M. J. Kozal, N. Shah, N. Shen, R. Yang and S. P. Fodor, Biotechniques, 19, 442-7 (1995).
11)R. J. Sapolsky and R. J. Lipshutz, Genomics, 33, 445-56 (1996).
12)E. M. Southern, J. Mol. Biol., 98, 503-17 (1975).
13)J. C. Alwine, D. J. Kemp and G. R. Stark, Proc Natl Acad Sci U S A, 74, 5350-4 (1977).
14)F. C. Kafatos, C. w. Jones and A. Efstratiatis, Nucl. Acids Res., 7, 1541-52 (1979).
15)E. M. Southern, G. S. Case, J. K. Elder, M. Johnson, K. U. Mir, L. Wang and J. C. Williams, Nucleic Acids Res, 22, 1368-73 (1994).
16)U. Maskos and E. M. Southern, Nucleic Acids Res, 21, 4663-9 (1993).
17)E. M. Southern, U. Maskos and J. K. Elder, Genomics, 13, 1008-17 (1992).
18)C. Pease, D. Solas, E. J. Sullivan, M. T. Cronin, C. P. Holmes and S. P. Fodor, Proc Natl Acad Sci U S A, 91, 5022-6 (1994).
19)S. P. Fodor, R. P. Rava, X. C. Huang, A. C. Pease, C. P. Holmes and C. L. Adams, Nature, 364, 555-6 (1993).
20)J. DeRisi, L. Penland, P. O. Brown, M. L. Bittner, P. S. Meltzer, M. Ray, Y. Chen, Y. A. Su and J. M. Trent, Nat Genet, 14, 457-60 (1996).
21)J. L. DeRisi, V. R. Iyer and P. O. Brown, Science, 278, 680-6 (1997).
22)J. L. DeRisi, V. R. Iyer and P. O. Brown, Science, 278, 680-6 (1997).
23)M. S. Boguski and G. D. Schuler, Nat Genet, 10, 369-71 (1995).
24)G. Lennon, C. Auffray, M. Polymeropoulos and M. B. Soares, Genomics, 33, 151-2 (1996)
导言
MICROARRAY，是固定在固体基片上的大量DAN序列的微阵列，是许多复杂核酸样本中特定DNA序列定性和定量研究的有效工具。日益引起人们兴趣的MICROARRAY，已经用于基因作图、变异分析和基因表达的检测，并且，有希望成为科学研究和临床应用的标准工具。
从原理上和实践上，基因芯片都是已用于核酸定性、定量研究数十年的杂交方法（Southern blot[12]、Northern blot[13]、克隆杂交和点杂交[14]）的发展：标记样本，再与阵列杂交；杂交足够的时间后，适当地洗膜数次；然后，探针与固定在特定位置上的样本DNA互补杂交而显现杂交印迹。
用MICROARRAY做平行杂交研究的思想本身并不新鲜，排列在滤膜上的阵列已经被用了很多年[15-17]。然而，不同领域的技术进步已把那些相当笨拙的膜变成了今天更加实用、有效的平行基因分析的方法：首先，大规模的测序工程产生的信息使得DNA集合聚集在一起成为可能，而这些DNA相当于许多组织（从细菌到人）中的全部基因或大部分基因；其次，技术进步已经使得生产高密度DNA阵列成为可能，从而使成千上万个基因展现在比标准的载玻片还小的面积上；最后，核酸荧光标记和荧光检测的进步使得这些芯片的应用更加简便、安全和准确。
本综述旨在描述一种微阵列技术的最新用法，通常被称作“点片”或“印片”。之所以这样称呼是因为该方法是将通常的大于寡核苷酸（100bp以上）的DNA通过物理分配方法点在固体基片上，这与最近其它主流的微阵列技术（短的寡核苷酸被直接合成在固体支持物上[18，19]）方法不同。在标准的点片操作中，把DNA样本（PCR产物、质粒等）装在96或384孔板中，用一个配有一束特殊设计点样针的机械手伸入板中相邻的样本孔中，吸上大约１µl的DNA样液，分别点在处理过的载玻片上。通过交叉的方式，用适合96孔板的４根一束针头或384孔板的16根一束针头成功地将数千个DNA样本点在一个玻片面上。用束状点样针接触每张玻片表面，可同时成功点100-200张具有同样阵列的芯片。每点完一次后，要清洗、干燥点样针，然后再装载另几个DNA样液。点完所有的点阵之后要处理玻璃片，使得DNA固定在玻片表面，以最大限度地减少探针非特异性结合在芯片上。MICROARRAY已被用于很多不同的目的。通过MICROARRAY，数千个序列能立即被检测出来。这篇综述着重于基因芯片在基因表达研究中的应用以及在基因组表达检测中的应用原理，并详细描述了MICROARRAY的制作和使用过程。
基因表达的检测
基因表达检测的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、细胞的RNA的绝对表达量。可以先从样本中抽提RNA，再标记RNA，然后将这些标记物作探针与芯片杂交，就可得出原始样本中不同RNA的量。然而用于杂交的某个特定基因的RNA的量与在一个相应杂交反应中的信号强度之间的关系十分复杂，它取决于多种因素，包括标记方法、杂交条件、目的基因的特征和序列。所以芯片的方法最好用于检验两个或多个样本中的某种RNA的相对表达量。样本之间某个基因表达的差异性（包括表达的时间、空间特性及受干扰时的改变）是基因表达最重要的，而了解RNA的绝对表达丰度只为进一步的应用或多或少地起一些作用。
双色杂交：为了最大限度地增加差异显示的可靠性和精确性，我们用两种具有不同光谱的荧光染料标记两种不同样本，然后混合这两种探针，并同时与一张芯片杂交的方法来直接对比这两种样本。两样本中的一种基因的相对表达量可通过同源目的基因的两种染料的荧光强度的比值检测出来。这个比值对以上讨论的那些可能影响与某个特定基因杂交探针绝对量，但不影响两种标记探针杂交相对量的因素不敏感。
DNA基因表达谱芯片的应用范围：最简单的基因表达谱检测是比较两种不同细胞或组织样本中的与芯片阵列中相应基因对应的mRNA的相对丰度。例如，可对比试验干预前后，或经某种处理后连续时段内的细胞以及不同分化时期的细胞，也可以对比突变型和野生型之间的mRNA表达的不同方式。这种试验方法灵活，使研究者可以收集到有关每种基因表达调节的更准确信息。例如，通过一张芯片上的多核糖体RNA和总mRNA的对比杂交，可以测出每个基因的翻译效率；通过细胞核和细胞质中的polyA RNA样本的差异性杂交，可以估计出细胞核与细胞质中的每种polyA RNA的分布：同样的方法还可以调查其它类型的亚细胞单位。
I型和II型试验：许多受关注的生物学问题都能用双色杂交试验这种最简单的方法来研究。即两种样本直接在一张芯片上进行比较（被称为I型试验[20]）。然而，对于需要对比多个样本的复杂问题，这种直接的比较就不适用了。针对这种情况，我们使用一种替代的试验设计，即在每次杂交中加一个一般对照作参考，这样既保持了双色杂交内部对照的本质特征，又可形成在大量样本中的推断对比，而不需要每个成对样本单独对比（这样的试验设计为II型试验）。这种方法最普遍的应用是用于时段（time-course）试验[21]，即每个时点（timepoint）与一个原始时点作对比。由于在某个时点的一个特定基因的量相对于一个固定的参照（原始时点）而被检测，那么就可研究通过这个时段的每个基因的活动方式。参照物不一定与被检验的样本有关系，参照物最主要的属性是它应提供一个杂交信号，这样在芯片上任何一个目的基因的杂交信号比值的分母就不会为零。因为在被对比的大量样本中，一个理想的参照物对于每个样本来说，都是一样材料的混合，在这个混合物中，在一个样本中表达的任何一个基因，也会在参照物中表达出来。
仪器设备
制作和应用基因芯片，需要两种设备：一个是制作芯片的机械手（又称点样仪）和一个扫描芯片的装置，一般是一个激光共聚焦显微镜（或称扫描仪）。许多大的实验室和生物技术公司对基因芯片技术的冲动已被操作芯片试验所要求的较高专业技能和其惊人的价格所冲淡了。为了使该技术操作更方便，价格更可接受，我们设计了价格相对便宜，及对分子生物学家来说更易操作、不需要太多工程专业经验就能装配和操作的仪器。并且在网上（http://rana .stanford.edu/hardware）登载了详细的数据、设计结构和操作说明书。点样仪和扫描仪两项仪器总的价格大约是60000美金。
靶DNA的制备
靶DNA的选择：对于大规模基因表达的研究，每个被分析的基因都需要一个特定的杂交目标，从本质上讲，因为任何双链DNA样本（以及大部分单链DNA样本）都能被点在处理过的玻璃片上，所以点片用的靶DNA的选择很大程度上取决于所要研究的基因的可获得程度。对于那些基因组已被完全测序的有机体，最简单的方法是用PCR扩增基因组中已知的、预知的开放阅读框（或研究者感兴趣的子集）。寡核苷酸合成费用的不断降低（现在大约每对引物10美元）及96孔PCR仪的广泛应用使得这一方法十分可行，甚至对于相对大的基因组也适用。我们实验室已经用这种方法制作了来自于测序酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因组[22]大约6200个开放阅读框的芯片，其中含启动子和终止子。对那些基因组未测序或部分测序的，或者是基因组带有大量内含子的生物体，这种方法不适合。对于很多生物体，如人和小鼠，目前常用来自cDNA文库的带有特异性序列的克隆，以及ESTs来鉴定不同mRNA的转录物[23]，而与这些转录物相应的单个cDNA克隆就可以作为靶DNA用于点芯片。我们实验室最近已用这种方法制作了约10000个基因的人类基因芯片，点在芯片上的DNA序列是用PCR扩增的cDNA克隆（I.M.A.G.E. cDNA文库）[24]的插入片段。对于那些没启动基因组测序计划的或还没得到序列的有机体，来自cDNA文库的克隆（相当正规的实验室能最大限度地减少重复）也能作为点片的靶DNA。在预先没有关于序列、基因图位点和基因序列数据库编号的任何信息的情况下，也能收集到每个克隆的表达数据。
人们会发现，用小的DNA片段来代表每个基因要比用全长开放阅读框或1000bp cDNA更有益。例如，在相互之间有显著同源性的酵母基因中，用代表序列差异最大部分的PCR产物代替整个编码区，可增加两基因之间的鉴别力，每个基因理想的表达量是目前研究的一个复杂问题。
PCR扩增：一般来说，一个100µl的PCR反应所提供的DNA足可以点1000张芯片，我们大多数的100µl反应体系都是在96孔PCR仪(Perkin Elmer 9600s and9700s)中完成的。扩增的实验参数取决于所用的模板和引物的类型，然而限定PCR的模板、引物、dNTP、镁离子、标准缓冲液和酶是十分重要的。一般附加剂如甘油或明胶因改变表面张力或竞争玻片表面的附着位点而影响点片过程，应避免使用。
点样DNA的制备：为了纯化PCR产物以制备点样DNA，我们一般用异丙醇沉淀PCR产物，然后在3× SSC中以大约100 ng/µl的浓度重新悬浮DNA。沉淀既能在PCR孔板中又能在V型底96孔组织培养板中进行。首先在每孔中加入10µl 醋酸铵（3M，ph5.2）；再加110µl异丙醇（我们用异丙醇而不用乙醇，使得沉淀混合物的总体积减少到能与PCR孔板或组织培养板容积相适应）；置孔板于-20℃，1小时（如果时间不允许，这一步可省略）；4℃下，3500×g（或3500rpm）离心沉淀1小时；在孔板下放2-3层纸巾以防破碎。在一个离心机转头接头上可以叠放4块V底孔板一起旋转，在每块孔板之间放一个纸垫，然后把孔板小心地捆在一起，以防滑落。沉淀后，吸出或颠倒孔板来弃去液体。用100µl 70%乙醇（用95%乙醇配制，因为100%乙醇中可能含有荧光杂质）洗沉淀，再离心30分钟，吸去或轻轻倒出液体，在体积适合96孔板的抽干机中浓缩干燥沉淀，（我们用Savant Speed Vac Plus SC210A；如果没有该仪器可在空气中干燥沉淀，但要防止灰尘）。在10-15µl 3×SSC（ph7.0）中重悬沉淀，4℃下至少放置12小时，小心封好孔板，以免蒸发。因为过多的盐及DNA的浓缩会影响点片。重新悬浮后，把溶液转移到软板中（Fisher3911Micro Test III Fexible Assay Plates） 备用点片。封严孔板，储存于4℃或-20℃直到使用。在点片前，将孔板轻轻地离心一下，以保证所有物质都集中于孔底。
有些用户在用这种沉淀程序时，很难得到前后一致的结果。有很多从PCR反应中回收纯化DNA的附加方法，也能买到大量纯化PCR反应的试剂盒。我们没有对点片中的这种方法做过广泛的调查。这一步骤主要目的是尽可能减少对DNA终溶液的污染，盐、清洁剂、甘油、明胶和一些特定的粒子如过柱树脂等会影响后续很多点片步骤。如果操作这一步，必须十分小心，以确保去除DNA终溶液中的杂质。任何其他点片用的DNA溶液制备的替代方法都应先做小规模的试验，并且用于整个点片和杂交过程以确保合适。下面介绍已被成功使用的一种候选方法。
聚丙烯酰胺葡聚糖纯化法：这种方法的原理是用一个简单的凝胶过滤树脂，保留盐离子和其它一些小的分子，而排出PCR产物。因为DNA在水中洗脱而被排出，这样就不需要沉淀过程了。同上所述，操作时必须十分谨慎，以防树脂污染点片溶液。要纯化100µlPCR反应物，准备聚丙烯酰胺葡聚糖S400树脂（Sigma S400 HR）并以2:1的比例用ddH2O稀释。以100µl每等份分装到96孔滤板中（Polytiltronics UN800-PSC/mepp/D）。向板中加400µl ddH2O洗４次，用真空排枪(Vacuum Manifold)(Polyfiltronics UNIVAES)吸出液体，把这个滤板套入聚丙烯96孔板中，４℃，2000rpm （Ｂackman GS-6离心机，带有Ｇ.Ｈ.3.8转头和Ｂackman Microplus carriers）离心５分钟，弃去所有残留液体。加100µl双蒸水（ddH2O）如上方法离心。加100µlPCR产物混匀，倒入一个干净孔板中，在抽干机中干燥。最终用３×SSC重新溶解PCR纯化产物。
玻片的准备
我们的微阵列绝大多数是点在用左旋多聚赖氨酸（poly-L-lysine）修饰处理的载玻片上的。我们尝试过许多备选的修饰物，包括多种硅烷，但没有一个像poly-L-lysine这样简便而可靠。为了准备左旋多聚赖氨酸修饰的玻片，把准备的载玻片（Gold Seal 产品，目录号是3010）放在金属或玻璃架上（从Wheaton可以购到各种型号的架子），使玻片垂直固定，把架子放在一个合适型号的玻璃缸内。一定要使用玻片架，架子要放在低速离心机中，到此步结束时它们要被旋转干燥。最好避免把玻片从一种类型的架子上转移到另一种上。虽然大多数玻片盒上都标有“干净”，但处理玻片前再清洗是必要的。用50g NaOH溶解于200ml ddH2O，再加300ml 95%的乙醇（不要用100％乙醇）制备500ml碱性洗液，把玻片完全浸没在洗液中至少２小时，洗完用ddH2O全面冲洗５次，摇５分钟冲洗。保持玻片浸没在ddH2O中，一旦洗净玻片，它们暴露于空气中的时间越短越好，因为灰尘会影响修饰和点片的过程。准备修饰溶液（350ml），包含35ml poly-L-lysine（0.1％Ｗ／Ｖ溶于水，Sigma P8920）, 35ml灭菌过滤PBS和280ml ddH2O，把该溶液倒入一个干净的玻璃缸中快速把玻片从最后一次洗液中移到修饰溶液中。轻轻摇动溶液１小时，把修饰处理过的玻片插进一个装有干净ddH2O的缸中，上下抽动５次，把这个玻片架转移到一个低速离心机中（在架下放纸巾吸液体），旋转使玻片干燥（５分钟，室温下，1000rpm, Beckman Gs-6离心机，带有G.H.3.8.转子和Beckman Microplus carriers）。用铝箔包裹干燥的玻片，防止灰尘。把包好的玻片架放进一个真空干燥炉中，45℃，10分钟，真空干燥。把玻片从铝箔中取出放进一个干净的塑料玻片架上（木头和软木塞有可能会使玻片上粘上粒子，最好不用），用封紧的玻片盒室温贮存。这些玻片不能马上用于点片，必须被固化（或风化）至少数周，使其表面充分疏水干燥（玻片一般在修饰处理一个月后用于点片），修饰处理后的玻片表面的疏水性对于保证DNA样点足够小以形成高密度阵列是十分重要的。一批玻片准备就绪，就要作抽样质检，方法是取出一张玻片，在其表面放150µl H2O, 把玻片与水平呈45度角，观察水滴在玻片表面滑落，如果留下明显的滑落轨迹，就说明该玻片已经可以使用。然而，检验玻片是否能用于点片,唯一最可靠的方法是在这一批玻片中先点几张作实验（见点片一节）。
点DNA微阵列
用于点DNA微阵列的机械手是标准的“取--放”式机械手的改进。在标准点片操作中，一大批载玻片被固定在一个平台上，溶于３×SSC的DNA样本放置于96或384孔板中，此板放在一个支持物上，机械手上有一束专用的弹性载样点片针，机械手将这些点片针伸入相邻的装有DNA样品的孔中，大约每根针吸装１µl DNA样品溶液。然后这些点样针在多个Poly-lysine处理过的玻片上特定位置点一小滴DNA（<0.5nl）,在每张玻片上点完DNA后，要清洗和烘干点样针，然后吸取下一批DNA样本，并在距上一次点片点很小距离的新位置重复此过程，从而形成高密度的点阵（阵列）。点间距取决于所点DNA液滴的大小，而液滴的大小又取决于点片针的特点和锐利程度以及poly-L-lysine表面的疏水程度。我们常规是用样点圆心间距约200µm的距离来点片，也可以将此距离缩小到近100µm。在200µm的距离下，整个酵母基因组能点于一张1.8cm2的玻片上，而在100µm的距离下，大约75000个人的基因能点于一个标准的１×３显微镜玻片上。我们现在的机械手大约用２分钟完成每个循环（洗针、烘干、载样、同时点110张玻片）。我们使用４个针为一束的点样头，针与针之间的距离正适合标准96孔微孔板的临近孔距。这样其点片的效率是110张片子每小时120点。只要在机械手技术上稍作改进，就可以把一个循环的时间缩短到一半。我们已经在384孔板以每16根针为一束的点样针进行点样，这种配置可达到在每110张上，每小时约点1000点的效率，或６小时点完酵母整个基因组。扩增到32个针（２倍面积）将能在110张片子上把整套人类基因在２天内点完。
点片针：作为机械手上与DNA和玻片接触的唯一部分，点片针是制作基因芯片最关键的构成。我们用的点片针（见图2）在原理上与鹅毛笔相同，通过毛细作用，把液体吸起，当点片针与玻片表面接触时，再把液体点下。针的制作是先在一个不锈钢圆柱的中间挖一个槽，圆柱的一端被削成圆锥体状，其中间的槽直通尖部。针尖中槽的两侧是紧贴在一起的，当它接触玻片时两侧才分开，使样液流出。针尖可用手工进一步削尖。当针尖浸入DNA溶液中时，液体被吸入载样槽中。当针尖轻轻点在玻璃上时，DNA只在这一点流出。在点片过程中，很多其它因素会影响点的大小（玻片的疏水程度，房间的湿度），一般来说，越尖的针头，点出的点越小，所以针头必须尽量保持尖锐。因为我们的点片针是用半手工方式制作，所以他们的表现并不完全一致。此外，尽管高质量的针尖可使用数10万次而无明显损坏，但针尖仍需要保养。所以制作一张好的芯片，保持针尖的高质量是最重要的一步。把针尖浸入一个超声波清洗器sonicator（Branson 3200）中漂浮来清洗针尖，再把针尖浸入清水中，把针尖浸入３×SSC中来灌洗针尖，使液体吸入载样槽中。选择一套装置，放在点片机前，通过试验点片来检测针尖的质量。试验点片的过程是只把一张玻片放在平台上，把针尖浸在新鲜的试验溶液中（包含溶于３×SSC的100ng/µl的鲑鱼精DNA），以点中心之间最适合点片的距离在一张芯片上点几百次（机械手的软件配有做这种试验点片的各种选择距离的程序）。试验点片后，再检验玻片。点片用的DNA溶液含盐量高，容易看清每一点大小、形状（见图3）。仔细检验玻片确保：１.每个针尖都把DNA样液点在了玻片上，至少在数目上是一样的；２.同一张片上，点的大小和形状大致相同；３.所有针尖所点的样点大小、形状大致相同。如果不能点出样液，原因既可以是载装DNA失败，也可能是点片时滴出DNA失败。首先要确保针尖点触到玻璃；其次确保针尖装载上了DNA，这可以通过把针尖移开支架，慢慢地把它浸入鲑鱼精试验溶液中（如前所述），吸起液体到灯光下，看是否液体被吸入载样槽中，如果针尖没有载样，是否DNA溶样不够粘稠（如果此溶液配制正确并新鲜,应和上述的靶DNA一样粘稠），然后，继续用超声波清洗法或用一个薄（<100µm）的不锈钢片来清洗载样槽。如果针尖已经载样，但仍不能点样液，很可能是针尖堵塞。取下针尖，拆开检查，可用超声波清洗法或轻轻地用一个薄片插入针尖来清洗。注意不要损坏针尖，针尖的两端不能相互接触，否则会阻止DNA滴出。
如果点太大或邻近的几个点融合在一起，可能是针尖不够尖锐或点玻片时用力太大。首先降低点片的冲力，然后拆下针尖用细砂纸和磨石磨锐针尖。点过大也可由于玻片疏水程度不够或表面活性剂污染DNA溶液。从审美角度上来讲，样点的大小应该一致，但只要能保证点够大而独立，点的大小、形状差异并不是一个严重问题。这种状态下的玻片至少可在1个月内保持稳定。
如果试验点片的一切情况均好，试验点片过程也要至少重复一次，然后马上开始正式点片，点片过程一旦开始，所要做的只是往点样仪中更换微孔板和检测点样质量。只要点样过程运行良好而恒定，则尽量不要中断点片过程。在点片时，微孔板是开放的，很容易蒸发（这样会改变样液的粘度而影响点片），因此，在一个大平台上一次加多个微孔板的设计是不明智的除非有能在点片前迅速开盖和制冷的微孔板，以最大限度减少蒸发。
在点样过程中，要密切检测样液是否持续点出及每点的大小、形状是否适当（注意：常常是前几张玻片所点出的DNA太多，如果芯片仍能看得过去，就不要停止点片过程）。最常见的问题是针尖堵塞而停止点样。如果发生这种情况，应立即中断点样过程，用上述方法清洗堵塞的针尖。针尖恢复正常，继续开始点样。另一个问题是灰尘或纤维塞进针尖而改变点的形状。这也需要清洗针尖。如果在点片时，针尖变钝会引起另一个不同的问题，即点太大，相邻点融叠，这可通过换针尖和磨锐针尖得以解决。
点片完成后，点阵的区域应用某种方式划出轮廓，因为洗脱盐份后，肉眼就看不见点阵了。我们一般用带钻石尖的刻板笔划出点阵区的边界线。必须用这种刻板笔来标记玻片，因为其它笔（如钢笔）所作的标记会在处理过程中被洗掉。然后把标记完的玻片从平台上取出，放在一个干燥的玻片盒中，贮存在凉爽干燥的地方。如果不需立即作后处理，这种状态下的玻片至少可以在1个月内保持稳定.
玻片的后处理
点样后微阵列用于杂交前需要四个步骤的处理：再次水合化和快速干燥、UV交联、封闭、变性。
再次水合化：点样过程一般不会将样点的DNA在该点均匀分布，为了使DNA在样点的各处均匀分布，需将在点样过程中很快干燥的各点再次水合化并快速干燥。这是一个精密过程，因为再次水合不充足将导致各点大小不规则，并降低总体杂交信号，而过分水合会导致点与点溶合。将标准台式加热装置(VWR Scientific Products H2025-1)的金属板翻转过来，这样可以产生一个平整金属表面。将加热板升温至80°C，在一个用塑料制成的玻片水合舱(Sigma H6644)的水池中装入热水(约50－60°C)，将每张玻片的点样面接近水面，让水蒸气水合各基因点，直至可以看到所有点出现折射光(一般需5－15秒)，立即将玻片放在加热板上，点样面朝上，直至干燥(一般需5秒)。这种处理需要实践技巧。尽管每批水合所需时间不同，甚至同张玻片上各点所需时间变化很大，但用温控水浴装置进行水合，仍会得到一致性更好的结果。有一些研究小组偏爱在低温下水合较长时间。我们的实验室没有试用过这种方法，但低温条件有可能降低这种过程的温度敏感性。
UV交联：玻片经再次水合化和快速干燥后，可用紫外线照射使DNA交联到玻片上。虽然不是关键步骤，这一处理可增加各点上稳定固定、可杂交DNA的量，尤其是点样液中DNA浓度较低时。将玻片以点样面朝上放在交联仪(Strategene UV 1800 Stratalinker)的塑面上，将时间模式转换至总能量模式，照射能量为60mJ(按Stratalinker说明操作)。
封闭：是后处理中最关键步骤。剩余自由赖氨酸经修饰后可以降低和标记探针DNA结合力。如果这些基团不被封闭，标记探针就会非特异地结合到玻片表面，并产生极高背景。我们用succinic anhydride (Aldrich 23，969-0)进行酰化封闭。赖氨酸带电氨基对一个羧基碳原子进行亲核攻击，从而形成一个胺键并在分子链的另一端暴露一个自由羧基负电基团。除了将赖氨酸氨基基团转换成胺，这一新生物还有一个带负电的表面，从而可以进一步降低非特异结合DNA。
因为液相中封闭试剂的稳定性有限，封闭过程应快速是重要的。找一个玻璃缸，一个带柄的玻片槽，该槽应容易放进缸中。将玻片放入槽中，再将槽放入通风橱中，紧邻着玻璃缸。我们用的缸中盛有350ml溶液，按此比例放大至你所需要的体积以完全浸没玻片。取335ml水倒入一个500ml玻璃烧杯中。用记号笔在烧杯外壁标记液面位置，将水倒掉，并用95%乙醇冲洗烧杯，用纸巾小心拭干，放入一个磁力搅拌棒。将烧杯放在通风橱里的磁力搅拌器上。取15ml Sodium Borate (1M，pH8.0)放在烧杯边上待用。称6克 Succinic Anhydride放入烧杯，迅速倒入1，2-methyl pyrrolidinone (Sigma M6762)至335ml标记线，高速搅拌(该溶液此时应显澄清，尽管在封闭反应中略显黄色；如果一开始就显黄色，说明溶解物已经变质，不要再使用)。Succinic Anhydride溶解后，立即加入Sodium Borate搅拌至溶液混匀(约5秒)，将溶液倒入玻璃缸中，迅速将玻片槽浸入液面下，并上下晃动玻片5次。将玻片槽封口(玻璃盖或铝箔)，轻柔摇晃玻片槽15分钟。
变性：在封闭反应进行时或在这之前，准备一个大烧杯或玻璃缸(要足够大以容得下封闭步骤中的玻片槽)，装入一些沸水，体积应至少是封闭液的两倍。封闭反应即将结束前，停止加热，待水不再沸腾时，迅速将玻片放入水中，上下提拉晃动3-5次并让玻片坐浴2分钟。将玻片立即放入装有95%乙醇的玻璃缸(再次提醒，不要用加水稀释100%乙醇配制而成的95%乙醇)。上下提拉玻片槽3-5次，将玻片放入离心机，甩干。经过以上处理的玻片就可以用于杂交了。
制备探针
分离RNA：我们成功尝试了各种方法制备的RNA，包括热酚抽提、异硫氰酸胍稳定及其它方法等，这些方法已在别处综述过，就不在此赘述了。我们也成功尝试了Invitrogen的FastTrak 2.0 mRNA isolation kits (Invitrogen K1593-02)，用于抽提人和酵母的样品。主要判定指标为产出高质量的RNA。对基因表达研究来说，最好的结果是用poly-dA RNA作为逆转录模板，尽管，至少对酵母菌来说，用总RNA作为逆转录模板也取得了好结果。一个好实验对每种标本需要至少1µg(越多越好)polyA RNA(或100µg总RNA)以用作合成荧光标记cDNA探针的模板。扩增小量RNA的方法正在尝试之中， 与在这讨论的方法进行比较。
标记：已有许多方法用于从RNA制备标记探针。在多数情况下，我们直接在oligo-dT为引物进行逆转录反应时标记cDNA。在某些条件下，用随机引物进行cDNA合成也可用于标记，尽管此方法不是对所有微阵列设计都适用。例如，由3’端序列组成的微阵列更适用于oligo-dT反转录的cDNA探针，由完整cDNA序列或含预测开放阅读框架序列构成的微阵列对两种逆转录方法都适用。样品还可在未标记的第一链合成后进行第二链合成时再标记。以下列出三种方法。
荧光染料：很多荧光染料标记的双脱氧核苷酸可由商业渠道取得。出色的结果是用Cy3-和Cy5-dUTP获得，两者激发光谱分得很开，用多种酶均可获得特异活性掺入，干燥后就可激发荧光，从而简化了图象获取过程。我们取得良好结果的其它荧光染料包括R110 (Perkin Elmer)、TAMRA (Perkin Elmer)和SpectrumOrange(Vysis)。
oligo-dT和随机引物逆转录标记：所有试剂应经过灭菌及DEPC处理。RNA溶于10µl水中，该溶液应包括一些对照RNA(参见本文后半部分)。加2.5µl(6µg)引物(20-mer oligo-dT，anchored oligo-dT，random hexamer或random nonamer：2.5µg/µl，用水配制)。70°C水浴10分钟以变性RNA，放于冰上。将下列试剂混合：2µl MMLV逆转录酶(GibcoBRL SuperScriptII Rnase H- Reverse Transcriptase kit; 目录号 18064-014)，6µl 5×first-strand buffer (SuperScript kit; 250mM Tris-HCl， pH 8.3， 375 mM KCl， 15 mM MgCl2)， 3µl 0.1 M DTT(也在试剂盒中)， 6µl 5×nucleotides (2.5 mM dATP，2.5 mM dCTP，2.5 mM dGTP，1.0 mM dTTP)，3µl 1mM Cy3或Cy5标记的dUTPs (Amersham)。上述混合液加入RNA-引物溶液，终体积为30µl，42°C保温1小时。加入1µl SuperScript II逆转录酶，42°C再保温1小时。加1.5µl 20mM EDTA以终止反应，加入15µl 0.1M NaOH降解模板RNA，70°C孵育10分钟，立即加入15µl 0.1M HCL以中和样品(荧光染料，尤其是Cy5对高PH敏感)。将样品放入Microcon30微浓缩器(Amicon)，并加入500µl TE (10 mM Tris，pH 8.0，1 mM EDTA)，在台式离心机上高速离心5-10分钟，以调整体积至10-20µl，弃流出液，加500µl TE，再次离心。二次离心后，Microcon滞存的探针应显著比流出液清亮。这一个成功标记反应的非常有力的指示现象。如果没有一点颜色滞存，标记反应就不太可能产生好的染交结果。将离心柱反转，再离心1分钟，以收集探针，将Cy3、Cy5标记的探针混合，并TE调整体积至500µl，用离心柱调整体积至8µl(到此，颜色应显紫色)。加2µl封闭液，封闭液含10g/µl 20-mer oligo-dA，10µg /µl yeast tRNA以及10µg/µl human cot-1 DNA (用于人探针时，GibcoBRL目录号15279-011)。加入2.1µl 20×SSC(终浓度为3.5×)和0.4µl 10%SDS(终浓度为0.3%)。注意加SDS时，枪头外壁不应有SDS，因为过多SDS会对杂交反应产生负影响。将样品放入100°C水浴1分钟，以变性样品。该样品应在实验台上自然冷却。对人样品，应在室温下放置30分钟，以允许cot-1酶切DNA片段与重复序列杂交，对酵母样品来说，样品一旦冷却下来即可用于杂交反应了。对杂交面积为2cm×2cm的阵列来说，杂交液体积适宜用12µl，杂交面积越大，也就需要更大体积的杂交液。
用Klenow酶标记cDNA：用以上方法制备cDNA模板，唯一例外之处是5×核苷酸溶液中的每种dNTP浓度为2.5mM(即逆转录反应中每种dNTP的终浓度均为0.5mM)，不含荧光染料标记的核苷酸。按前述方法调节样品至终体积20µl，加入3µl随机引物(hexamer或nonamer，4µg/µl)，100°C变性1分钟，置实验台上冷却5分钟。加入5µl 10× buffer (100mM Tris-HCl， pH 7.4， 50 mM MgCl2， 75 mM DTT)， 5µl 10× nucleotides (0.25 mM dATP，0.25 mM dCTP，0.25 mM cGTP，0.09 mM dTTP)，1.5µl 1mM Cy3或Cy5 dUTP(Amersham)，2µl(10U)无外切酶活性的Klenow酶(USB，目录号E700572)，13.5µl ddH2O至终体积50µl。37°C温育4小时。按前述方法纯化样品并准备杂交。
杂交
用台式离心机将探针样品高速离心1分钟，以沉淀任何可能的杂质。用移液枪将样品吸加到阵列中央，注意不要碰到离心管中任何沉淀并避免形成气泡。封盖玻片(要足够大以覆盖整个阵列杂交区表面)，注意不要形成气泡。在该玻片的另一区域滴加5µl 3×SSC，以提供杂交舱内湿度，由此可以确保杂交过程中探针混合物不会蒸干。将玻片放入封口的杂交舱中，并浸入65°C水浴，4-6小时。
杂交后处理
杂交后，小心擦干杂交舱并移出玻片，浸入盛有洗液1(2×SSC，0.1%SDS)的玻片槽中，玻片点样面朝下，这样当盖玻片掉落时不会划伤阵列表面。剥落盖玻片后，将玻片在洗液中晃动2-3次后移入盛有洗液2(1×SSC)的玻片槽中，小心操作，尽可能减少洗液1混入玻片槽2中，因为SDS会干扰玻片图象质量。轻柔摇晃玻片槽2分钟，将玻片移入盛有洗液3(0.2×SSC)2分钟，然后离心甩干玻片。所有洗液温度均应为室温。改变这些步骤的温度和时间会改变杂交的严谨性。
参照
由于微阵列试验的高平行性，所以在每张阵列反应中加入多种参照物是可能的而且是很有价值的。下面将描述一些有用的参照。
掺入RNA：在探针制备过程的各个阶段加入已知量的参照RNA，对检测和评价每次实验的各个方面是非常有用的。很明显，选用的掺入RNA不应与待研究的有机体的RNA有交叉杂交，但两者总体特性应相近(GC含量、长度、poly-A尾巴)。许多酵母菌基因可以在人基因表达阵列上用作参照，因为两者在核苷酸水平的同源性很有限。将上百个这样的基因点于人的基因阵列上只是显著增加了点样时间。将这些基因克隆到带有噬菌体RNA聚合酶结合位点和人造poly-A尾巴的质粒上，就可以制备用于各个实验阶段的参照基因的大量RNA。此类参照可用于各个方面，例如，参照RNA可以按不同比例或以不同总浓度掺入Cy3、Cy5标记反应，由此可以测定杂交严谨性、输入比和输出比的校正以及检测灵敏度。
RNA质量参照：某一类型核酸与互补靶基因结合的量与互补序列长度有关。所以某一给定cDNA的杂交信号强度随RNA质量好坏而不同。这会导致不能理解的微阵列杂交结果，例如，用不同质量的同一RNA衍生得到的等量cDNA用于杂交时，会看到ratio值明显不相同。谨慎选择靶基因序列可使这个问题的影响最小化。对oligo-dT逆转录的cDNA，如果靶基因序列局限在3’端，则对RNA质量最不敏感。RNA质量可由相应参照物方便地检测，例如叠瓦式覆盖整个基因的长度为100-200bp的一组DNA片段可以用于测定待比较样品中的RNA相对质量，而降解RNA及由oligo-dT逆转录标记的cDNA于5’序列含量较多的基因杂交会产生相应比例的弱信号。制备叠瓦式基因片段作为参照，在RNA和探针制备的各个阶段掺入进去，例如，收获细胞时、分离poly-A RNA时、探针标记时以及杂交前，由此可以鉴定设计RNA质量问题的实验步骤。
封闭参照：如前所述，由于探针和靶基因之间存在非基因特异性的相似性，尤其是由重复序列引致的，大多数杂交反应需加入冷DNA进行封闭。与此类潜在的混淆序列相应的参照靶基因可用于检测封闭是否成功。例如，如果重复序列被成功封闭，在人类基因表达阵列上含有人cot-1酶切DNA片段的基因点应产生极弱或甚至阴性信号。其它有用的阴性参照包括oligo-dA、oligo-dT、质粒DNA和人基因组DNA。
归一化参照：对多个样品来说，很难准确制备完全等量的参照mRNA标记探针，所以加入一些预期在相互比较的2个样品中的杂交信号一致的参照基因是非常有用的。例如，对酵母菌表达实验来说，酵母菌总基因组DNA制备的靶基因可用于校正两样品间的信号，而人基因表达实验的校正更复杂，由于只有一小部分基因组是表达的，人总基因组DNA杂交信号应该非常低。
扫描玻片和数据处理
杂交后应获取针对实验所用2种荧光染料的微阵列荧光图像。我们使用的装置是激光扫描共聚焦显微镜(扫描仪)。扫描仪有一个激光管(或一组激光管)，可以产生与所用荧光染料激发光谱相应的某一波长激光。激光穿过一标准物镜照亮玻片上的一个点，激发荧光被物镜聚集后又穿过一系列滤镜(以去除激发光波)、一个校准透镜和一个极小孔眼(以降低噪音，这使得它成为一个共聚焦装置)，并在一个光电倍增管中进行计量。激光束快速扫描玻片后获得微阵列的一幅光栅图像。用一对galvanometer将光束定位于固定玻片上的各个点，或用泛光照射源和CCD镜头，也可获得相似图像。我们发现共聚焦扫描装置所获结果最好，因为其信噪比优于galvanometer或CCD。
如前所述，实验最终目标是测定玻片上每一点的两种荧光染料的相对信号值。有多种方法可以完成这一任务，最常见者是将图像栅格化，然后计算每方格中每种荧光染料的平均荧光强度，两样品中基因相对含量就变成了两种荧光信号强度的比值。这种计算可能会受诸如对大多数阵列可见到的非零荧光背景进行补偿计算的影响。我们开发了相应软件，可运用多种算法准确估算背景值，并用更复杂的算法直接测定相对荧光强度比值。这个会和计划中的价格不贵的共聚焦扫描仪一起面市。
点样问题
用到DAN微阵列的实验会在任一步骤中遇到技术问题，而由微阵列提供的加入多种内参照方法将有助于识别和校正许多问题。确实，甚至有严重瑕疵的实验也常提供足够多的有用新信息。明智的实验设计是，只要有可能，就应安排实验的每一步骤都能重复而无需重复整个实验，例如多准备些mRNA和玻片阵列，应多于实际需要量，这就是聪明之举。
十全十美的阵列图像是罕见的。我们碰到的许多问题很难追踪原因，而且在阵列扫描之前无法用可检测手段证明这些原因。我们建议在杂交珍贵样品前设立多级质量控制。成批的左旋多聚赖氨酸修饰玻片应加以质检，可取小量修饰好的玻片进行点样并测试整个后处理和杂交过程。只有小量玻片测试成功，同一批次的大量玻片才用于真正的点样。一旦玻片点样后，应对小量点样玻片进行后处理，后处理是否成功可用已知应产生良好结果的RNA制备的探针进行测试来判定。最后，所有阵列在杂交前应扫描一次，弃去那些有明显污点的玻片(划伤或任何影响左旋多聚赖氨酸修饰的因素均可被检测为微阵列上的背景荧光)，并弃去那些杂交前背景就高的阵列。左旋多聚赖氨酸和其它修饰物在对应于Cy3波长激发光下会发弱荧光，由于一些未知原因这种荧光在玻片之间有变异，偶尔强度达到能干扰杂交信号。另外，样点上的DNA在此激发波长下也会发出弱荧光且在玻片之间有变异。如果这些杂交前荧光信号源中的任一种的强度处于或接近杂交玻片上的信号，就应弃去这些阵列。以下讨论最常见问题(见图5)中的某一些。
样点的形状问题：一个常见问题就是部分或所有点有“彗星尾”，任一点的拖尾与其它点的拖尾方向一致，样点的颜色也反映在拖尾中。这一现象可能由于没有完全而快速地将玻片浸没在Succinic Anhydride封闭液中所致。使从样点洗脱的DNA又结合到玻片上。若拖尾的样点彼此是分离的，这些有彗星尾的玻片依然是可用的。与样点总体外观有关的另一现象是“面包圈孔”。按前述方法用点样针点样时，它并不是留下一个均一的圆，较多物质滞聚在样点的外围部分，就使得中央部分相对空当。这一现象可由延长再次水合化时间来解决。再次水合化时间再次延长些，那么彗星尾、面包圈孔就不会让一张玻片浪费，实际上只是稍稍在数据质量上作了一点妥协。
高背景：由于异常的高荧光背景而导致的芯片模糊是常见的问题。高背景即可出现在整个芯片的杂交表面，也可出现在一个局部区域。我们可以估计高背景的可能来源，但要确切地查明某种高背景的来源是困难的。在试图判断高背景问题时，弄清高背景在玻片上的位置是十分重要的。如果在杂交前预先系统地扫描芯片，覆盖整个芯片的明显高背景是可以避免的。高背景局限于杂交区，说明标记的探针粘着于玻片表面，在洗片步骤时没有被冲洗掉，导致这一结果有两种可能性，一是poly-lysine的氨基基团封闭不足，或是在杂交中标记的探针非特异吸附。这种来源的高背景通常伴随着“anti-probe”现象，此高背景只出现在非样点区域，这很可能反映出这一区域的poly-lysine容纳点片DNA能力降低。在某种情况下，芯片的一边背景较差，提示与玻片在液体媒介（最可能是封闭液）中被如何放置有关。通常高背景易出现在盖玻片的边缘，可能提示探针在杂交中脱水析出，这一问题可通过在杂交舱中加多点3× SSC，并确保封好杂交舱而得以解决。均一的高背景也可能是由于探针制备不好导致，因为小的探针片段或不合格的荧光核苷结合在表面引起高背景却不影响杂交信号。
局部信号微弱：大部分高背景现象都伴随特异性信号减弱，因为探针的信号被芯片表面的高背景所掩盖。然而，不伴有高背景的信号微弱也可能发生，经验认为这是因为这一区域探针层太薄而引起的。芯片或／和盖玻片表面的气泡和不匀质也能引起这种结果。仔细选择和放置玻片与盖玻片可减少这个问题。
结论
MICROARRAY是在基因组范畴内进行探索、研究的有力工具。多年来生物学家已经能研究少量条件下的大量基因或多种条件下少量基因的差异表达。基因芯片第一次使上千种条件下研究成千上万个基因成为可能。对于那些基因组序列已知的生物体（如Saccharomyces Cerevisiae）这一技术使同时研究其所有基因表达成为可能。对于人类，应用同样方法的唯一局限性就是需要已知基因的数据；人类完整的转录物鉴定和测序将在以后几年完成。过去，由于实验工具的局限迫使大部分基因表达类型的设计仅徘徊于某种假设，和被限定于我们有限知识的基础上。而现在我们可以设计实验去系统地探索生物学广大的未知领域。作为研究工具的MICROARRAY的实用性就在于它的灵活简便及价格低廉。所以在我们研发这项技术的种种可能的改变时，注重它的研究目标、简便性和低廉性，在我们改进这项技术时，应本着尽可能降低它在经济、使用和心理方面障碍的原则，以使一个独立的实验室在一年内就能完成基因组范围内成千上万个基因研究。
拥有点样机、扫描仪的独立实验室可以在一年内进行某种条件下成百万个不同基因的表达或其特征的检测。这一史无前例的收集大量基因表达信息的技术发展速度惊人，以至于出版、分发、保存的机制和相应标准的建立速度尚无法赶上研究所产生结果的速度；另外整理、观察、解释大量信息的分析软件仍处于发展的初级阶段。但这不会成为基因表达和其他功能研究的阻碍，这一新的前沿技术给生物领域的开拓者展现出了新的挑战机遇。
参考文献
1)J. DeRisi, L. Penland, P. O. Brown, M. L. Bittner, P. S. Meltzer, M. Ray, Y. Chen, Y.Su and J. M. Trent, Nat Genet, 14, 457-60 (1996).
2)M. Chee, R. Yang, E. Hubbell, A. Berno, X. C. Huang, D. Stern, J. Winkler, D. J.Lockhart, M. S. Morris and S. P. Fodor, Science, 274, 610-4 (1996)
3). L. DeRisi, V. R. Iyer and P. O. Brown, Science, 278, 680-6 (1997).
4)F. Forozan, R. Karhu, J. Kononen, A. Kallioniemi and O. P. Kallioniemi, Trends Genet,13, 405-9 (1997).
5)R. A. Heller, M. Schena, A. Chai, D. Shalon, T. Bedilion, J. Gilmore, D. E. Woolley and R. W. Davis, Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 2150-5 (1997).
6)D. A. Lashkari, J. L. DeRisi, J. H. McCusker, A. F. Namath, C. Gentile, S. Y. Hwang, P. O. Brown and R. W. Davis, Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 13057-62 (1997).
7)L. Wodicka, H. Dong, M. Mittmann, M. H. Ho and D. J. Lockhart, Nat Biotechnol, 15, 1359-67 (1997).
8)M. Schena, D. Shalon, R. Heller, A. Chai, P. O. Brown and R. W. Davis, Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 10614-9 (1996).
9)M. Schena, D. Shalon, R. W. Davis and P. O. Brown, Science, 270, 467-70 (1995).
10)R. J. Lipshutz, D. Morris, M. Chee, E. Hubbell, M. J. Kozal, N. Shah, N. Shen, R. Yang and S. P. Fodor, Biotechniques, 19, 442-7 (1995).
11)R. J. Sapolsky and R. J. Lipshutz, Genomics, 33, 445-56 (1996).
12)E. M. Southern, J. Mol. Biol., 98, 503-17 (1975).
13)J. C. Alwine, D. J. Kemp and G. R. Stark, Proc Natl Acad Sci U S A, 74, 5350-4 (1977).
14)F. C. Kafatos, C. w. Jones and A. Efstratiatis, Nucl. Acids Res., 7, 1541-52 (1979).
15)E. M. Southern, G. S. Case, J. K. Elder, M. Johnson, K. U. Mir, L. Wang and J. C. Williams, Nucleic Acids Res, 22, 1368-73 (1994).
16)U. Maskos and E. M. Southern, Nucleic Acids Res, 21, 4663-9 (1993).
17)E. M. Southern, U. Maskos and J. K. Elder, Genomics, 13, 1008-17 (1992).
18)C. Pease, D. Solas, E. J. Sullivan, M. T. Cronin, C. P. Holmes and S. P. Fodor, Proc Natl Acad Sci U S A, 91, 5022-6 (1994).
19)S. P. Fodor, R. P. Rava, X. C. Huang, A. C. Pease, C. P. Holmes and C. L. Adams, Nature, 364, 555-6 (1993).
20)J. DeRisi, L. Penland, P. O. Brown, M. L. Bittner, P. S. Meltzer, M. Ray, Y. Chen, Y. A. Su and J. M. Trent, Nat Genet, 14, 457-60 (1996).
21)J. L. DeRisi, V. R. Iyer and P. O. Brown, Science, 278, 680-6 (1997).
22)J. L. DeRisi, V. R. Iyer and P. O. Brown, Science, 278, 680-6 (1997).
23)M. S. Boguski and G. D. Schuler, Nat Genet, 10, 369-71 (1995).
24)G. Lennon, C. Auffray, M. Polymeropoulos and M. B. Soares, Genomics, 33, 151-2 (1996)
