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丁香园论坛
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本人刚刚开始做DNA抽提实验,遇到一些问题,请教大家。
1)关于酚的PH值。
我从公司买了一瓶tris饱和酚,略呈黄色,分上下两层。上层水相,下层是酚。我测了PH值,上层PH值是8,下层是5左右,我用试纸测的,没敢拿PH计测。问题是分子克隆那本书上说酚用tris平衡至PH值8.0,可是现在买的酚却是酸性的,怎么办呢?是自己再用tris平衡还是直接就能用啊?请有经验的战友解答,可能问题很菜,呵呵,谢谢大家帮忙。
2)提取细胞DNA时,从哪一步开始不能剧烈震荡呢?
我是提培养的贴壁细胞的DNA,细胞消化下来后,PBS重悬2遍,6000转离心后加裂解液。发现细胞抱团,不易分散开来,书上说提取DNA是操作一定要轻柔,可是如果不震荡的话,细胞不能分散开来会不会影响细胞裂解的效果呢?所以,请教大家,提取过程中是不是从一开始就要求轻柔,或者说从哪一步开始要轻柔呢?谢谢大家。
3)下面是我今天操作的过程,请大家看看有没有问题。
1、细胞消化,PBS重悬2次,吸干多余的PBS,加入1ml裂解液,震荡混匀,37度孵育1h,加入25ul的蛋白酶K(终浓度是100ug/ml)
2、50度水浴过夜。
3、加入等体积的tris饱和酚(就是购买的tris饱和酚的下层液体),颠倒混匀,6500转离心15min,取上清液(离心后液体分上下两层,但是奇怪的是我并没有看到有中间层的白色薄膜层,书上说的应该有这一层,是蛋白质。但是我看到的只有两层,并未见到这个白色层,是怎么回事呢?)。
4、上清液加入等体积的氯仿异戊醇(24:1),颠倒混匀,离心后取上清。
5、上清液加入0.2倍体积的10mol/L的醋酸钠(100ul)以及2倍体积的无水乙醇,混匀。按照书上说的,此时应该有DNA沉淀形成,确实,我也看到了白色沉淀,量比较多,但是当然离心后倒去上清液是,用枪尖吸取剩余的液体时无意中发现沉淀中居然有很硬的东西,怀疑是不是有盐析出??不知道大家有没有遇见过这个东西,到底是怎么回事呢?
6、75%乙醇洗涤沉淀2次,离心收集DNA。
7、吸净残留的乙醇,室温下干燥,加500ulTE溶解。
实验到这里就结束了,跑胶后发现什么也没有。不知道是**作有问题是配对液体有问题,请大家帮忙。
另外我陪的裂解液是:10mmol/L tris-Cl (PH8.0), 0.1mol/L EDTA (PH8.0), 0.5% SDS(0.5g SDS溶解于100ml上述混合溶液)。
请各位战友帮忙,分析一下。指点一下。可能问题很菜,但是对初学实验的人来说,一点点很小的细节也可能导致实验的失败,请大家帮忙。谢谢大家,祝大家新年快乐。
1)关于酚的PH值。
我从公司买了一瓶tris饱和酚,略呈黄色,分上下两层。上层水相,下层是酚。我测了PH值,上层PH值是8,下层是5左右,我用试纸测的,没敢拿PH计测。问题是分子克隆那本书上说酚用tris平衡至PH值8.0,可是现在买的酚却是酸性的,怎么办呢?是自己再用tris平衡还是直接就能用啊?请有经验的战友解答,可能问题很菜,呵呵,谢谢大家帮忙。
2)提取细胞DNA时,从哪一步开始不能剧烈震荡呢?
我是提培养的贴壁细胞的DNA,细胞消化下来后,PBS重悬2遍,6000转离心后加裂解液。发现细胞抱团,不易分散开来,书上说提取DNA是操作一定要轻柔,可是如果不震荡的话,细胞不能分散开来会不会影响细胞裂解的效果呢?所以,请教大家,提取过程中是不是从一开始就要求轻柔,或者说从哪一步开始要轻柔呢?谢谢大家。
3)下面是我今天操作的过程,请大家看看有没有问题。
1、细胞消化,PBS重悬2次,吸干多余的PBS,加入1ml裂解液,震荡混匀,37度孵育1h,加入25ul的蛋白酶K(终浓度是100ug/ml)
2、50度水浴过夜。
3、加入等体积的tris饱和酚(就是购买的tris饱和酚的下层液体),颠倒混匀,6500转离心15min,取上清液(离心后液体分上下两层,但是奇怪的是我并没有看到有中间层的白色薄膜层,书上说的应该有这一层,是蛋白质。但是我看到的只有两层,并未见到这个白色层,是怎么回事呢?)。
4、上清液加入等体积的氯仿异戊醇(24:1),颠倒混匀,离心后取上清。
5、上清液加入0.2倍体积的10mol/L的醋酸钠(100ul)以及2倍体积的无水乙醇,混匀。按照书上说的,此时应该有DNA沉淀形成,确实,我也看到了白色沉淀,量比较多,但是当然离心后倒去上清液是,用枪尖吸取剩余的液体时无意中发现沉淀中居然有很硬的东西,怀疑是不是有盐析出??不知道大家有没有遇见过这个东西,到底是怎么回事呢?
6、75%乙醇洗涤沉淀2次,离心收集DNA。
7、吸净残留的乙醇,室温下干燥,加500ulTE溶解。
实验到这里就结束了,跑胶后发现什么也没有。不知道是**作有问题是配对液体有问题,请大家帮忙。
另外我陪的裂解液是:10mmol/L tris-Cl (PH8.0), 0.1mol/L EDTA (PH8.0), 0.5% SDS(0.5g SDS溶解于100ml上述混合溶液)。
请各位战友帮忙,分析一下。指点一下。可能问题很菜,但是对初学实验的人来说,一点点很小的细节也可能导致实验的失败,请大家帮忙。谢谢大家,祝大家新年快乐。