荧光定量PCR技术研究进展
丁香园
2016
荧光定量PCR技术研究进展
多聚酶联反应（PCR）可对特定基因进行扩增，因此被广泛应用于获取特定基因或基因片段及临床基因诊断等领域。早期最成功及普及的应用领域是获取某一目的基因，用于基因诊断有许多局限性，主要有两点，一是不能准确定量；二是由于太灵敏，容易交叉污染，产生假阳性。为克服上述不足，人们采取了许多方法，如杂交法、竞争法、酶联法及尿苷酶降解法等，但均不很成功，直到最近荧光能量传递技术（FRET）就用于PCR定量后上述问题才得到较好的解决。本文综述目前国内外几种荧光定量PCR的原理及应用现状。
1.TaqMan
TaqMan技术是PE公司开发的，目前已开始应用于基因检测。该技术的基本原理见图1。它利用了Taq酶的5’外切酶活性，合成一个能与PCR产物杂交的探针，该探针的5’端标记一个荧光分子，3’标记另一个荧光分子。其中3’端荧光分子能够吸收5’端荧光分子发出的荧光，因此正常情况下该探针检测不到的5’端荧光分子发出的荧光，只能检测到3’端荧光分子的荧光信号，但当溶液中有PCR产物（模板）时，该探针与模板结合，激活Taq酶的5’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。其主要不足是：（1）采用荧光淬灭及双末端标记技术，因此淬灭难以彻底，本低较高；（2）采用酶外切活性，因此定量时受酶性能影响；（3）探针标记成本较高，不便普及应用。TaqMan技术在HCV病人血清HCV RNA定量分析及基因遗传突变分析等领域有广泛应用。
2.Amplisensor(Biotronics)
Amplisensor也是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物，另一探针连接一淬灭物。两探针长度不同，其中一种探针5’端多出7个碱基（GCGTCCC）。PCR扩增前需将此探针与PCR引物连接，PCR引物的5’末端应有一端与长探针互补的序列，以便连接酶将引物与探针连接。扩增时该探针一引物复合物中的代引物部分作为半套式引物参入到模板，从而释放出淬灭探针部分，破坏了FRET，而产生荧光。荧光的强度与扩增时加入的模板数成正比。该方法的主要特点；（1）由于采用了半套式PCR扩增可提高灵敏度，但无法区分因引物二聚体形成产生的非特异扩增信号，这样定量准确度受影响；（2）每次PCR反应前，要先进行Amplisensor的标记，增加了操作步骤和检测成本；（3）中间需要加入半套式引物，增加污染机会。
后来有人对上述方法进行了改进，将合成时将荧光探针的3’末端。这种改进虽然省去了PCR扩增前的连接步骤，但仍无克服非引物二聚体等非特异扩增信号对定量结果产生的影响。
3.Molecular beacon
分子信标技术也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子，与TaqMan探针不同的是，该探针5’和3’末端自身可形成—8个碱基左右的发卡结构，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时该探针与模板杂交，从而破坏了探针的发卡结构即FRET，于是溶液便产生荧光，荧光的强度与溶液中探针的量成正比，因此可用于PCR定量分析，该方法的特点是采用非荧光染料作为淬灭分子，因此荧光合成时标记较复杂。分子信标技术结合不同荧光标记可用于基因多突变位点同时分析，如结核杆菌耐药基因rpoB的耐药分析。
后来，Nazarenko等基于MB的原理，使用了一种发卡引物式引物（Sunrise primer）,这一方法的特点是所有的扩增产物均能标记上荧光分子，因此荧光信号响反快，但无法共分特异和非特异扩增是其致命的不足。
最近 Whitcombe等上述方法进行了改进，发明了一种称之为蝎状引物（scorpion primer）的荧光定量PCR技术，该技术在引物与MB探针之间连接一个间隔臂，使PCR延伸反应时不能够延伸至MB分子，这样非特异扩增产物便无荧光信号，但当有特异扩增产物时MB即可与扩增产物进行分子内杂交，产生荧光信号。既解决了非特异问题，又保留了其响应快的特点。但是仍存在杂交时探针不能完与模板匹配及合成复杂的问题。该方法已成功地就髟于k-ras及BRAC2基因的突变分析.
4.Lightcycler
LightCycler是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术，该技术的特点也是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发光探针和淬灭探针，发光探针的5’端连接荧光分子；淬灭探针的3’端连接荧光分子。由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬来分子便紧密相邻，从而发生FRET而使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此可以进行PCR定量分析。该方法的特点是淬灭效率高，但由于两个探针结合于模板上因此影响扩增效率，此外由于需要合成两个较长的探针，因此合成成本相对较高。
多聚酶联反应（PCR）可对特定基因进行扩增，因此被广泛应用于获取特定基因或基因片段及临床基因诊断等领域。早期最成功及普及的应用领域是获取某一目的基因，用于基因诊断有许多局限性，主要有两点，一是不能准确定量；二是由于太灵敏，容易交叉污染，产生假阳性。为克服上述不足，人们采取了许多方法，如杂交法、竞争法、酶联法及尿苷酶降解法等，但均不很成功，直到最近荧光能量传递技术（FRET）就用于PCR定量后上述问题才得到较好的解决。本文综述目前国内外几种荧光定量PCR的原理及应用现状。
1.TaqMan
TaqMan技术是PE公司开发的，目前已开始应用于基因检测。该技术的基本原理见图1。它利用了Taq酶的5’外切酶活性，合成一个能与PCR产物杂交的探针，该探针的5’端标记一个荧光分子，3’标记另一个荧光分子。其中3’端荧光分子能够吸收5’端荧光分子发出的荧光，因此正常情况下该探针检测不到的5’端荧光分子发出的荧光，只能检测到3’端荧光分子的荧光信号，但当溶液中有PCR产物（模板）时，该探针与模板结合，激活Taq酶的5’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。其主要不足是：（1）采用荧光淬灭及双末端标记技术，因此淬灭难以彻底，本低较高；（2）采用酶外切活性，因此定量时受酶性能影响；（3）探针标记成本较高，不便普及应用。TaqMan技术在HCV病人血清HCV RNA定量分析及基因遗传突变分析等领域有广泛应用。
2.Amplisensor(Biotronics)
Amplisensor也是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物，另一探针连接一淬灭物。两探针长度不同，其中一种探针5’端多出7个碱基（GCGTCCC）。PCR扩增前需将此探针与PCR引物连接，PCR引物的5’末端应有一端与长探针互补的序列，以便连接酶将引物与探针连接。扩增时该探针一引物复合物中的代引物部分作为半套式引物参入到模板，从而释放出淬灭探针部分，破坏了FRET，而产生荧光。荧光的强度与扩增时加入的模板数成正比。该方法的主要特点；（1）由于采用了半套式PCR扩增可提高灵敏度，但无法区分因引物二聚体形成产生的非特异扩增信号，这样定量准确度受影响；（2）每次PCR反应前，要先进行Amplisensor的标记，增加了操作步骤和检测成本；（3）中间需要加入半套式引物，增加污染机会。
后来有人对上述方法进行了改进，将合成时将荧光探针的3’末端。这种改进虽然省去了PCR扩增前的连接步骤，但仍无克服非引物二聚体等非特异扩增信号对定量结果产生的影响。
3.Molecular beacon
分子信标技术也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子，与TaqMan探针不同的是，该探针5’和3’末端自身可形成—8个碱基左右的发卡结构，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时该探针与模板杂交，从而破坏了探针的发卡结构即FRET，于是溶液便产生荧光，荧光的强度与溶液中探针的量成正比，因此可用于PCR定量分析，该方法的特点是采用非荧光染料作为淬灭分子，因此荧光合成时标记较复杂。分子信标技术结合不同荧光标记可用于基因多突变位点同时分析，如结核杆菌耐药基因rpoB的耐药分析。
后来，Nazarenko等基于MB的原理，使用了一种发卡引物式引物（Sunrise primer）,这一方法的特点是所有的扩增产物均能标记上荧光分子，因此荧光信号响反快，但无法共分特异和非特异扩增是其致命的不足。
最近 Whitcombe等上述方法进行了改进，发明了一种称之为蝎状引物（scorpion primer）的荧光定量PCR技术，该技术在引物与MB探针之间连接一个间隔臂，使PCR延伸反应时不能够延伸至MB分子，这样非特异扩增产物便无荧光信号，但当有特异扩增产物时MB即可与扩增产物进行分子内杂交，产生荧光信号。既解决了非特异问题，又保留了其响应快的特点。但是仍存在杂交时探针不能完与模板匹配及合成复杂的问题。该方法已成功地就髟于k-ras及BRAC2基因的突变分析.
4.Lightcycler
LightCycler是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术，该技术的特点也是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发光探针和淬灭探针，发光探针的5’端连接荧光分子；淬灭探针的3’端连接荧光分子。由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬来分子便紧密相邻，从而发生FRET而使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此可以进行PCR定量分析。该方法的特点是淬灭效率高，但由于两个探针结合于模板上因此影响扩增效率，此外由于需要合成两个较长的探针，因此合成成本相对较高。
