湿兄，我有块蜡肉，怎么才能毕业？

刚入师门的呆萌·王最近悲喜交加。师傅董太师看他骨骼清奇颜值高，便给了他「镇组之宝」——一块尚方宝肉，并拍拍他的肩膀，「小王，拿着这个好好做，稍微做出点东西，你就能顺利拿上学位，当上小 PI，迎娶白富美，走向人生巅峰！」小王兴高采烈拿着这沉甸甸的宝肉，但左右思量都觉无从下手呀！便去请教大湿兄傲娇·李，「师兄，师傅给了我一块宝肉，让我做点东西，你说我是油炸、清蒸还是红烧好呀？我寻思，我可能还做不过门口的黑料大爷呢，咋办？」傲娇·李听了，噗呲笑了， 「你个吃货～董太师的意思，是让你做组化 IHC 啊！」「IHC，啥来头？」李湿兄扶了扶眼镜， 「IHC 可不是啥新鲜事儿，早在上个世纪七十年代，便已有人使用这项技术。近年来，随着『无图无真相，王道即真理』观念的强化，越来越多的研究使用这项古老且神秘的技术检测组织标本中特定蛋白的表达和分布，使科学假想与体内环境有机结合，让科学论文的质量得以升华。」

以下是烧脑宝典，欲练此功，无需自宫

IHC 简而言之，统共分成七步：脱蜡／复水，抗原修复，淬灭（去除内源性过氧化物酶），封闭，抗体孵育及 DAB 显色。前三步形似泡澡堂，后三步形似 Western blot。

泡澡之前，我们得脱衣服，脱蜡就是给石蜡切片「脱衣服」的过程，即，用二甲苯将石蜡从切片上「脱」下来，总共脱 3 次，每次 5 min。在进澡堂子之前，我们得穿上澡堂提供的浴袍，让自己融入澡堂的环境。复水的目的就是利用乙醇的双溶性，使得切片跟后续的水溶性实验体系相容。这一步中，我们使用 100% 乙醇和 95% 乙醇各洗切片 2 次，每次 10 min。

接下来，我们就能进入 IHC 中极为重要的一步——泡澡，哦不，是抗原修复了。抗原修复的目的是将抗原表位得以暴露，使得后续的一抗可以结合上去。目前而言，抗原修复的方式主要分为热修复和酶修复两种，其中热修复是在微波炉或者高压锅中，切片在沸腾温度（95～99℃）加热一段时间后完成，所用到的修复液主要有柠檬酸缓冲液（pH＝6.0），EDTA（pH＝8.0）和 TE（pH＝9.0）三种；酶修复则是在 37℃ 温箱中进行，利用胃蛋白酶、胰蛋白酶或者蛋白酶 K 进行的酶解作用达到抗原修复的目的，使用这种修复方式需注意对修复液进行预热，使其在切片放入前，就已达到酶类的最佳反应温度。

抗原修复是 IHC 中最重要的一环，目的蛋白抗原表位的修复效果影响着后续的一抗结合效果，即影响着最终的结果。在实验开始前，仔细阅读抗体说明书，查看其推荐的修复条件。跟泡澡体验相似的是，人太多体验感就差，同理，在修复时不要贪多贪快，微波炉中一次只修复一缸，并根据容器体积，加入其推荐的修复液的量（CST 的推荐用量为 250 ml）。

此外为了保证实验具有良好的重复性，我们推荐使用浓缩修复液，这不仅简化了实验准备工作，而且使实验批次间所使用的修复液组分达到更佳的稳定性。

在上述大事完成后，我们进行的是 IHC 特色项目——淬灭（即去除内源性过氧化物酶）。目前绝大多数 IHC 都是基于 HRP 检测系统，所以我们需要去除组织中内源性过氧化物酶的活性。只需在 3% H₂O₂ 中浸泡 10 min 即可。

此时的切片，便形似一张湿转后的 western blot 膜——方方的载体上分布着我们的蛋白。

为了减少二抗与组织的非特异结合，我们需使用二抗来源的血清进行封闭。由于 CST 的绝大多数一抗为鼠抗（mouse）和兔抗（rabbit），对应的二抗来源于羊（goat），所以我们使用 5% 正常羊血清（溶剂为 TBST），将其滴加到组织上，室温封闭 1 h 即可。

我们也可以使用 CST 新推出的不含动物组分的封闭液 (Animal-FreeBlocking Solution (5X) #15019)，以达到更佳、更具实验稳定性的封闭效果。

擦去封闭液后（后方的同志注意了，不是洗去！不是洗去！不是洗去！），如同 western blot 一样，我们可以进行一抗孵育。一抗的特异性对染色结果有着至关重要的作用。正所谓抗体选不好，Figure 有烦恼；抗体一跑偏，结果就坑爹。为了提高实验的成功率及可信度，一定要选择经过周（dì）密（yù）严（mó）格（shì）验证的高（C）大（S）上（T）抗体，并根据说明书的提示，使用特定的稀释体系配置抗体工作液。

敷有一抗的切片在 4℃ 过夜并经洗涤后，进行二抗孵育。二抗的效力及其与一抗的契合度也影响着染色结果。CST 开发出了具有高灵敏度的二抗，可以与一抗成为融洽的 soulmate。

二抗孵育并洗涤后，将新鲜配置的 DAB 显色液滴加至切片上，进行显色反应，即棕黄色颗粒的形成。在显色过程中，需对切片严密监控以控制合适的显色程度（一般 1～10 min），当获得合适的染色强度后，将切片浸泡于 dH₂O 中，终止显色。

Competitor antibodies used in accordance withmanufacturer recommendationsSignalStain?DAB Substrate Kit #8059:

IHC analysis of paraffin-embedded human breastcarcinoma using Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP? Rabbit mAb #9145. Chromogenicdetection was performed using #8059 (left) or DAB supplied by a competitor(right).

显色结束后，可以根据实验需要进行核复染。核复染可以凸显细胞结构，并有利于结果的观察和判读。目前，多数研究者使用的核复染试剂为苏木精 (Hematoxylin #14166)，将细胞核染成蓝色。

最后，对切片进行脱水、封片（DAB 显色系统，可使用中性树胶）。就能在显微镜下细细端详品读实验结果啦。

「原来如此，我赶紧买上 CST 的抗体试剂，向我的小康生活迈进去！」小王迎夕阳欢乐地扭动着小背影离开了。