活细胞培养观察方法

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培养活细胞可用相差显微镜，也可用缩时摄影直接记录活细胞的动态变化，还可将离体活细胞染色。

一、相差显微镜直接观察法

活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光镜无法看清未经染色的活细胞。为了观察活细胞的结构，则需要通过其他途径提高结构的反差。20世纪30年代，荷兰物理学家Zernike设计的相差显微镜利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈清晰可见的明暗对比，从而成功地解决了生物学上的难题。

相差显微镜由相差聚光器和相差接物镜两个主要部分组成。它与普通光镜相比多了两个部件，一个是在聚光器上增加一个环形光阑，使透光聚光器的光性形成空心光锥、聚焦到标本上。另一个是在物镜的后焦面增加一个相板，相板有一个环形区，其大小适好通过环形光阑的直射光，相板各区渡以不同物质，使得通过环形区的光比通过相板其他部位的光超前或滞后1/4波长。相差显微镜的基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提供了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰可见。光性透过标本后，发生折射，偏离了未通过标本的的光性的光路，这两租光性和轴后，则发生相互干涉现象。透过生物标本发生折射的光性与未透过标本的光性之间产生了光程差。前者被阻滞了1/4波长。如果把光程差再增加了1/4波长，则变为1/2波长，和轴后两束光线的干涉加强，使标本周围发生晕圈，提高了可见度。

用相差显微镜可观察活细胞，并可在镜下连续拍摄记录体外培养细胞的活动，如细胞分裂 、细胞迁移运动等过程。相差显微镜观察活细胞的步骤如下：

1、调整好相差显微镜

首先调好相位板使聚光器相位板号与接物镜方法倍数相一致。然后抽出接目镜，再换辅助镜，移动辅助镜筒并调整聚光器相位板，使视影中两个大小一样的光环相互吻合。再从新换上原接目镜，即成相差图像。当更换不同倍数接物镜时，需按上述过程重新调节。

2、观察培养瓶(皿)准备

准白观察的培养瓶(皿)要平坦，质地均匀，透光性好，在观察前将培养瓶(皿)面擦净，勿流任何残留污迹。

3、调光

主要调整照明光的照明度和光轴，令视野照明均匀。首先用低倍镜，并把照明灯虹彩光调至最小，使光落于视野中央;如有偏斜可用聚光器的调整螺丝进行调整。然后打开虹彩光使视野内呈均匀照明强度，并使目的物图像达到最大限度反差为止。

4、调焦与摄影

较高级的相差显微镜视野中间都有双线十字，调焦前先转动目镜使十字的双线清晰，然后再用调焦旋钮调节物镜，使观察物体清晰。在照相目镜上也要采用同样步骤调焦。摄影目镜与观察目镜焦点不一致时，也要根据需要调焦，一般照相时以摄影目镜为主，观察时以观察目镜为主。

照相时应做好记录，把细胞种类、代数、观察内容、放大倍数、时间等一一记录下来，以备日后检查和对比。

5、细胞观察

生长在瓶底上的细胞悬液最适宜用倒置显微镜相差显微镜观察，而且需附有长焦距聚光器，才能观察厚度较大的培养瓶(皿)。若用油镜观察细胞微细结构，需用支持物培养法，把细胞培养 在长形盖片上，观察时从瓶中取出制成临时标本。方法为：取一大型载物片，再取一块优质滤纸剪成长方窗形，置于载物片上，用吸管向纸框中滴数滴培养基，充满框内空间和浸湿纸框;把生长有细胞的盖片含细胞面向上放在纸框中，再辅以大盖片。观察时应不断从标本侧面滴加加适量营养液，以防不断蒸发。此法只限于短时间观察细胞之用。

二、暗视野显微镜观察活细胞

暗视野显微镜是利用特殊的聚光器，是照明光线斜射不能进入物镜，所以视野是暗的，只有经过标本散射的光线才能进入物镜被放大，在黑暗的背景中呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，甚至可以观察到5nm的微小质点。这种观察方法主要用于观察物体的轮廓，分辨不清内部的微细结构，只适合观察活细胞的细胞核 、线粒体，液体介质中的细菌和霉菌等。所以这种方法已较少应用。

三、缩时显微镜摄影观察

这是随着现代科技发展而出现的一种新的观察方法。缩时显微镜摄影术可直接记录活细胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜 变化、细胞死亡等过程。显微镜闭路电视系统或接上观察细胞变化的定格电视记录装置，则更直接地观察到细胞的变化，但由于这套系统较昂贵，所以应用尚不普通。

四、离体活细胞染色观察

1、中性红染色

中性红是常用的活体染色体 染料，常用的浓度为1：10000，用生理盐水(或Hanks液)溶解后进行高压蒸汽灭菌暗处存放，可直接浸染活细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑，肉眼计算空斑数目。因其毒性大，染色后细胞不能再培养。

2、结晶紫染色

使用浓度为0.1%，可用生理盐水，室温保存。盖染料对死、活细胞均着色，故只能测出细胞总数。

3、台盼蓝染色

用0.5%浓度的台盼蓝，用PBS配制，室温保存，盖染料只对死细胞着色，可测定活细胞和计算存活百分率。