碱性磷酸酶－抗碱性磷酸(APAAP)免疫组化染色技术检测淋巴细胞表面标记

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　　(一)　基本原理
　　APAAP(Alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase technique) 技术的基本原理为: 抗鼠IgG抗体作为桥梁，将鼠源性识别细胞抗原的第一抗体与鼠源性的抗碱性磷酸酶单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物相连接，使之成为Ag，-Ab１－Ab２-anti AP-AP的复合物。还可通过二抗将APAAP 复合物重复叠加起来，从而使多个碱性磷酸酶标记于组织细胞上第一抗体所识别的抗原部位，提高了敏感性。

　　　　　　　　　　图　　APAAP技术原理

　　(二)　方法
　　 分离外周血单个核细胞(PBMC)，洗涤后用含10％FCS犚PMI1640
调整细胞浓度约5×10６／ml
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　　　　　自制制片机上制片，充分干燥
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　　　　　　　　用含丙酮-福尔马林固定液中固定30秒钟
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　　　　　　　　　　　自来水、蒸馏水依次冲洗
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　　　　　　用TBS稀释特异性McAb或阴性对照抗体(1∶50～500)，
　　　　　　　　　　　　　每片加30～50μl
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　　　　　　　　室温湿盒孵育30min，或4℃冰箱湿盒中过夜
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　　　　　　　　充分用TBS冲洗后，加1∶50羊(兔)抗鼠IgG
　　　　　　　　　　　　(GAM或RAM IgG)30～50μl
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　　　　　　　　　　　　室温湿盒孵育30min
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　　　　　TBS冲洗后加碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(1∶2000)复合物(APAAP)
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　　　　　TBS冲洗后可重复叠加GAM或RAM IgG和APAAP2次，每次孵育10min
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　　　　　　　　　　冲洗后底物液显色10～15min
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　　　　　　　　　自来水冲洗，苏木精衬染，光镜下观察
　　(三)　试剂器材
　　载玻片，制片机，湿盒，光学显微镜
　　1.　APAAP配制：牛肠碱性磷酸酶Ⅶ型(Sigma)4.3μl或粗酶2mg溶于1ml 0.05M,PH7.6的TBS，加抗碱性磷酶单克隆抗体腹水2μl制成，临用时作1∶2～1∶4稀释。
　　2.　AP底物配制：Naphathol(萘酚)AS-MX(Sigma) 25mg溶于1ml二甲基甲酰胺，加PH8.2, 0.1M Tris-HCl缓冲液49ml，再加Fast Red ITR (Sigma) 50mg，充分混匀，用前配制。必要时加12mg Levamisole以抑制内源性碱性磷酸酶。亦可按上述比例少量配制。
　　3.　丙酮-福尔马林固定液：4℃保存
　　　　100mg Na２HPO４
　　　　500mg KH２PO４
　　　　150ml H２O
　　　　225ml Acetone
　　　　125ml Formalin