ELISA试验的终极优化

互联网2015-01-05

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1 抗体的酶标记及质量鉴定 本试验采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在抗体上[1]，标记完后取上清用Sephedex G200 凝胶层析进行纯化，洗脱液为0.2mol/L pH7.4的PBS，流速为15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度计测A280吸光度值，以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标做图，收集第一峰即为酶标抗体峰。 标记完后用紫外分光光度计在分别在280nm、及403nm处测定酶标记物的A值，计算<a target="_blank">免疫</a>球蛋白量、摩尔比值、酶结合率以及标记率。

2 包被用缓冲液及最适包被抗原浓度的优化

2.1 包被缓冲液的优化 包被抗原时，为了得到最佳的包被效果，我们采用了碳酸盐缓冲液（50mM ph9.6 ）、磷酸盐缓冲液（50mM ph7.6）、以及TRIS盐酸缓冲液（50 mM ph7.6）三种缓冲液作为包被液，抗原包被浓度为5ug/ml，及2.5ug/ml,酶标抗体工作浓度为1：400及1：300，用自动酶标仪分析，选择最佳的包被缓冲液系统（表5）。同时为了保证缓冲液能够长期保存，我们在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作为防腐剂。

2.2 最适抗原包被浓度的优化 用优化好的包被缓冲液，将包被抗原（ALB）稀释成0.1ug/ml，1.0ug/ml，2.0ug/ml，4.0 ug/ml，6.0 ug/ml，8.0 ug/ml，10.0 ug/ml等六个浓度，包被微孔板，每孔100ul；竞争抗原浓度为4.0 ug/ml，2.0 ug/ml；酶标抗体稀释度为1：300，经孵育、显色、终止后用自动酶标仪分析（表6）。显色的强度在一定范围内与包被的抗原量成正比，但随着包被抗原浓度的增加，显色的强度反而降低，我们选择临界包被值作为包被抗原量。

3 封闭液、洗涤液及保护液的优化

3.1 封闭液的优化 采用文献报道的方法进行封闭，其封闭液的组成为：10mM磷酸盐缓冲液含1%的牛血清白蛋白（BSA）。

3.2 洗涤液的配制 采用文献报道的方法配制洗涤液。

3.2 酶标板保护液的优化 酶标板经过封闭后在低温下仅能存放2周左右，为了延长固相酶标板上抗原的稳定性，我们增加了一步保护酶标板的程序。在10mM的磷酸盐中加入适量的糖、无关蛋白质、庆大霉素以及二价金属离子，作为酶标板保护剂，在封闭完后加入保护液于4℃冰箱中孵育过夜，同时与未做保护的酶标板进行对照，然后将保护的及未保护的酶标板置于37烘箱中放置15天，考察保护液对酶标板的稳定性的影响。