遗传病与肿瘤的基因诊断
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第四节 遗传病与肿瘤的基因诊断
从DNA水平上寻找确诊遗传病的指标或探讨遗传病和肿瘤的病因等方面，已取得很大成绩，这对产前诊断，早期确诊和突变基因携带者的检出等都有重要意义。所用的方法大体有以下几种。
一、分离基因进行结构分析
利用DNA离体转化，制备探针，制备基因文库进行筛检，最后鉴定 载体 中插入DNA片段的特性等一系列技术，可以设法分离出目的基因或某一特定的DNA顺序。然后通过DNA核苷酸顺序分析可以弄清楚某些疾病的病因。比如，人体癌基因的分离和研究癌基因同原癌基因在DNA的结构与功能上的差别，对了解细胞癌变的机制起了很大的作用。分离目的基因或专一DNA顺序更常用的是制备分子杂交探针，通过Southern印迹杂交或Northern印迹杂交等，了解某些遗传病患者基因结构上的差别，从而找到可靠的诊断方法。比如，患者的基因是否缺失，重排以及是否存在限制性片段长度的多肽现象等。
二、DNA限制性片段多态性连锁分析
DNA限制性片段长度多态性（restricition fragment length polymorphism, RFLPs）连锁分析法是指由于缺失、重排或碱基置换的结果，使DNA分子中原有的某种限制性内切酶的识别位点发生改变，或是消失或是增加，所以酶切后生成的DNA片段的长度也随之改变。这种DNA限制性片段长度的变化往往同某种疾病的连锁关系，因而可作为这种疾病的诊断指标。
如果所分析的DNA分子不太大，比如人体线粒体DNA，长16569bp。在这种DNA分子上每种限制酶的识别点不过几个到几十个，因此，当某种限制酶的识别点发生改变并经过这种酶切后，可清楚地看到DNA电泳带的图型发生改变，条带或者增加或是减少，条带所处的位置也有变化。可是，遗传病病例分析时所用的是 基因组 DNA，而基因组DNA从限制酶酶切后至少会生成100万个片段，多的可达1000万个片段。如果其中有一、二个片段发生改变，不可能从电泳凝胶上直接观察分辨。此时就必定要用合适的探针。某个目的基因或某一特定的DNA片段，在同酶切后的DNA作分子杂交后，可在曝光的X线片上看到RFLP。图23-8是用分子杂交法检测RELP示意图。
图23-8 分子印迹杂交法则 RFLPs的示意图
这是通过限制酶A识别点的改变出现DNA的RFLP，再以合适的DNA片段作为分子杂交的探针，在探针上标记了放射性同位素，同分别经酶A，酶B完全酶切的DNA作印迹杂交。在曝光后的X线片上可看到不同的杂交带图型。①是正常个体，经酶A和酶B切后的DNA同探针杂交，都只看到一条带。②是一个杂合子即隐性突变基因携带者的杂交图式，由于它的一条染色体的DNA分子中酶A的识别点发生改变，酶切后的DNA片段较原来的长，所以出现一长一短两个片段。③是突变基因纯合子，也就是患者，酶A和B的酶切片段虽然是各有一个，但A的片段比正常的个体长，所以杂交带出现的位置也有改变。从图23-8可以看出研究RFLP的两个重要因素，一是要制备合适的探针，二是要用尽可能多的各种限制性内切酶进行酶切和杂交。
1974年首次用RFLP作为遗传学分析的方法。1978年简悦威和Dozy等第一次用人体β珠蛋白基因作为探针，同限制酶Hpa Ⅰ酶切的DNA做杂交，发现了DNA的RFLP与镰形细胞 贫血 之间的关系（表23-4）。
表23-4 DNA的RFLP与镰形细胞贫血的关系
Hb基因型Hpa Ⅰβ珠蛋白基因片段（kb）
总计 13.0kb片段的频率
7.6/7.6
7.6/7.0
7.0/13.0
7.6/13.0
13.0/13.0 黑人AA
8
6
0
2
0
15
0.03 AS
5
1
1
9
0
16
0.31 SS
0
0
0
4
11
15
0.87 白人AA
12
0
0
0
0
12
0 亚洲人AA
15
0
0
0
0
15
0
由此可以看出，HpaⅠβ珠蛋白基因13.0kb片段可作为检出镰形细胞贫血及携带者的一种指标。1981年Geever等根据镰形细胞贫血是β珠蛋白第6个密码子的一个核苷酸置换的结果，用限制酶DdeⅠ酶切DNA后与β珠蛋白基因杂交。结果是：Hb基因型AA的正常个体有175bp和201bp二条带。SS个体即患者只有一条带，是正常人两个DNA片段长度之和，即376bp。AS杂合子则有三条带：175bp、201bp、376bp。其原因是第6个密码子中的A被T置换，使Hb A变成了HbS。限制酶DdeI的识别顺序为C↓TNAG，当A变成T后，该部位DNA顺序变成CTNTG，从而丢失了一个DdeI识别位点，所以HbA的2个DdeI片段（175bp、201bp）变成了HbS的一个DdeI片段（175+201=376bp）。
除了用基因作探针直接检测基因内的核苷酸变化引起的RFLP外，还有两种途径：一是用基因作探针，检测该基因两侧顺序中核苷酸变化引起的RFLP，确定这些RFLP与遗传病之间有无连锁关系。另一种是用克隆的专一DNA顺序作探针，检测基因两侧顺序DNA的RFLP与遗传病的连锁关系。迄今用上述三种方法已查明近30种遗传病可通过RFLP来检测。表23-5、6、7为部位举例。
表23-5 用基因作探针检测基因内的结构变化来直接分析遗传病
遗传病 探针 年代 抗凝血酶Ⅲ缺乏症 抗凝血酶Ⅲ基因 1983 α1抗胰蛋白酶缺乏症 合成的寡核苷酸 1983 动脉粥样硬化症 载脂蛋白A-基因 1983 糖尿病 胰岛素基因 1983 Ehlers-Danlos综合症 α（1）胶原蛋白基因 1983 生长激素缺乏症 生长激素基因 1981 乙型血友病 凝血因子ⅠⅩ基因 1983 遗传性胎儿血红蛋白持存症 β珠蛋白基因 1979，1983 HPRT缺乏症 HPRT基因 1983 自毁容貌综合征 HPRT基因 1983 成骨不全 原α 1
