普通光学显微镜

实验二 普通光学显微镜

　　一、目的要求

　　1．熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。2．学习并掌握油镜的原理和使用方法。

　　二、显微镜的基本构造

　　显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成（图Ⅲ-1）。

　　1．机械装置

　　镜座（base）和镜臂（arm）镜座位于显微镜底部，呈马蹄形，它支持全镜。镜臂有固定式和活动式两种，活动式的镜臂可改变角度。镜臂支持镜筒。

　　镜筒（body tube）是由金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种，单筒又可分为直立式和后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的，倾斜式镜筒倾斜45°。双筒中的一个目镜有屈光度调节装置，以备在两眼视力不同的情况下调节使用。

　　转换器（no sepiece）为两个金属碟所合成的一个转盘，其上装3—4个物镜，可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。

　　载物台（stage）又称镜台，为方形或圆形的盘，用以载放被检物体，中心有一个通光孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹，用以固定标本；有的装有标本推动器，将标本固定后，能向前后左右推动。有的推动器上还有刻度，能确定标本的位置，便于找到变换的视野。

　　调焦装置 是调节物镜和标本间距离的机件，有粗动螺旋（coarse adjustment）即粗调节器和微动螺旋（fine adjustment）即细调节器，利用它们使镜筒或镜台上下移动，当物体在物镜和目镜焦点上时，则得到清晰的图像。

　　2．光学系统

　　物镜（objective）物镜安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体，故又称接物镜。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如：NA0．30；10×；160/0．17；16mm。其中“NA0．30”表示数值孔径（numerical aperture，简写为NA），“10×”表示放大倍数，“160/0．17”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度（mm），16mm表示焦距。

　　目镜（ocular lens）装于镜筒上端，由两块透镜组成。 镜把物镜造成的像再次放大，不增加分辨力，上面一般标有7×、10×、15×等放大倍数，可根据需要选用。一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500—700倍，最大也不能超过1000倍的选择。目镜的放大倍数过大，反而影响观察效果。

　　聚光器（condenser）光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本，增强照明度和造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器由聚光镜和虹彩光圈（iris diaphragm）组成，聚光镜由透镜组成，其数值孔径可大于1，当使用大于1的聚光镜时，需在聚光镜和载玻片之间加香柏油，否则只能达到1．0。虹彩光圈由簿金属片组成，中心形成圆孔，推动把手可随意调整透进光的强弱。调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。

　　光源（light source）较新式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内，通过按钮开关来控制；老式的显微镜大多是采用附着在镜臂上的反光镜，反光镜是一个两面镜子，一面是平面，另一面是凹面。在使用低倍和高倍镜观察时，用平面反光镜；使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。

　　滤光片（filter）可见光是各种颜色的光组成的，不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的，分别透过不同波长的可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。

　　3．成像原理

　　普通光学显微镜的成像原理如图Ⅲ-2所示。

　　三、油镜物镜的基本原理

　　微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40—45×）和油镜（1．8 mm，95—100×）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI（oil immer-sion）字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000—2 000多倍。从图Ⅲ-3中可看出油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。

　　使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度（图Ⅲ-4）。

　　利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：

NA＝n·sinα

　　式中 NA=数值孔径；

　　 n=介质折射率；

　　α=最大入射角的半数，即镜口角的半数。　

　　因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大（图Ⅲ-5），该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，α的理论限度为90°，sin90°=1，故以空气为介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120°，其半数的正弦为sin60°=0．87，则：

　　以空气为介质时：

　　NA=1×0．87=0．87

　　以水为介质时：

　　NA=1．33×0．87=1．15

　　以香柏油为介质时：

　　NA=1．52×0．87=1．32

　　显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。