第五篇　实验技术--　寄生虫学实验技术--　寄生虫学实验诊断技术

第五篇　实验技术

第二十一章　寄生虫学实验技术

第一节　寄生虫学实验诊断技术

一、病原检查

（一）粪便检查

粪便检查是诊断寄生虫病常用的方法。要取得准确的结果，粪便必须新鲜，送检时间一般不宜超过24小时。如检查肠内原虫滋养体，最好立即检查。盛粪便的容器要干净，并防止污染与干燥；粪便不可混杂尿液等，以免影响检查结果。

1．直接涂片法　用以检查蠕虫卵、原虫的包囊和滋养体。方法简便，连续作3次涂片，可提高检出率。

⑴蠕虫卵检查：滴一滴生理盐水于洁净的载玻片，用棉签棍或牙签挑取绿豆大小的粪便块，在生理盐水中涂抹均匀；涂片的厚度以透过涂片约可辨认书上的字迹为宜。一般在低倍镜下检查，如用高倍镜观察，需加盖片。应注意虫卵与粪便中异物的鉴别。虫卵都具有一定形状和大小；卵壳表面光滑整齐，具固有色泽；卵内含卵细胞或幼虫。

⑵原虫检查：

1）活滋养体检查：涂片应较薄，方法同查蠕虫卵。气温愈接近体温，滋养体的活动愈明显。必要时可用保温台保持温度。

2）包囊的碘液染色检查：直接涂片方法同上，以一滴碘液代替生理盐水。如碘液过多，可用吸水纸从盖片边缘吸去过多的液体。若同时需检查活滋养体，可在用生理盐水涂匀的粪滴附近滴一滴碘液，取少许粪便在碘液中涂匀，再盖上盖片（图21－1）。涂片染色的一半查包囊；末染色的一半查活滋养体。

图21－1　原虫包囊碘液染色操作方法

碘液配方：碘化钾4g，碘2g，蒸馏水100ml。

3）隐孢子虫卵囊染色检查：目前较佳的方法为金胺酚改良抗酸染色法。对于新鲜粪便或经10％福尔马林固定保存（4℃1个月内）的含卵囊粪便都可用此法染色。染色过程是先用金胺－酚染色，再用改良抗酸染色法复染。方法步骤如下：

金胺－酚染色法：

①染液配制：1g／L金胺－酚染色液（第一液）：金胺0.1g，石碳酸5.0g，蒸馏水100ml；3％盐酸酒精（第二液）：盐酸3ml，95％酒精100ml；5g／L高锰酸钾液（第三液）：高锰酸钾0.5g，蒸馏水100ml。

②染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，10～15分钟后水洗；滴加第二液，1分钟后水洗；滴加第三液，1分钟后水洗，待干；置荧光显微镜检查。

低倍荧光镜下，可见卵囊为一圆形小亮点，发现乳白色荧光。高倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色，卵囊壁为一薄层，多数卵囊周围深染，中央淡染，似环状，或深染结构偏位，有些卵囊全部为深染。但有些标本可出现非特异的荧光颗粒，应注意鉴别。

改良抗酸染色法：

①染液配制：石炭酸复红染色液（第一液）：碱性复红4g,　 95％酒精20ml，石炭酸8ml，蒸馏水100ml；10％硫酸溶液（第二液）：纯硫酸10ml，蒸馏水90ml（边搅拌边将硫酸徐徐倾入水中；20g／L孔雀绿液（第三液）：20g／L孔雀绿原液1ml，蒸馏水10ml。

②染色步骤：滴加第一液于粪膜上，1.5～10分钟后水洗；滴加第二液，1～10分钟后水洗；滴加第三液，1分钟后水洗，待干；置显微镜下观察。

经染色后，卵囊为玫瑰红色，子孢子呈月牙形，共4个。其他非特异颗粒则染成蓝黑色，容易与卵囊区分。

不具备荧光镜的实验室，亦可用上述方法先后染色，然后在光镜低、高倍下过筛检查，发现小红点再用油镜观察。效果好，可提高检出速度和准确性。

2．厚涂片透明法（改良加藤法）取约5mg（已用100目不锈钢筛除去粪渣）粪便，置于载玻片上，覆以浸透甘油－孔雀绿溶液的玻璃纸片，轻压，使粪便铺开（20×25mm）。置于30～36℃温箱中约半小时或25℃约1小时。待粪膜稍干，即可镜检。

玻璃纸准备：将玻璃纸剪成22×30mm大小的小片，浸于甘油－孔雀绿溶液（含纯甘油100ml、水100ml和3％孔雀绿1ml的水溶液）中，至少浸泡24小时，至玻璃纸呈现绿色。

使用此法需掌握粪膜的合适厚度和透明的时间。如粪膜厚，透明时间短，虫卵难以发现；如透明时间过长，则虫卵变形，也不易辨认。

3．浓聚法

⑴沉淀法：原虫包囊和蠕虫卵的比重大可沉集于水底，有助于提高检出率。但比重较小的钩虫卵和某些原虫包囊则效果较差。

1）重力沉淀法：取粪便20～30g、加水成混悬液，经金属筛（40～60孔）或2、3层湿纱布过滤，再加清水冲洗残渣；过滤粪液在容器中静置25分钟，倒去上液，重新加满清水，以后每隔15～20分钟换水一次（3～4次），直至上液清晰为止。最后倒去上液，取沉渣作涂片镜检。如检查包囊，换水间隔时间宜延长至约6小时换一次（图21－2）。

图21－2　粪便沉淀及毛蚴孵化法

2）离心沉淀法：将上述滤去粗渣的粪液离心（1500～2000rpm/min）1～2分钟，倒去上液，注入清水，再离心沉淀，如此反复沉淀3～4次，直至上液澄清为止，最后倒去上液，取沉渣镜检。

3）汞碘醛离心（MIFC）沉淀法：粪便1g，加适量（约10ml）汞碘醛液，充分调匀，用2层脱脂纱布过滤，再加入乙醚4ml，摇2分钟，离心（2000rpm/min）1～2分钟，即分成乙醚、粪渣、汞碘醛及沉淀物4层。吸弃上面3层，取沉渣镜检。

汞碘醛配制：

　　①汞醛（MF）液：1／1000硫柳汞酊200ml，甲醛（40％）25ml，甘油50ml，蒸馏水200ml。
②卢戈氏液：碘5g，碘化钾10g，蒸馏水100ml。

检查时取汞醛液2.35ml及5％卢戈氏液0.15ml混合备用。但混合液在8小时后即变质，不应再用；碘液亦不这且于1周后再用。

4）醛醚沉淀法：置粪便1～2g于小容器内，加水10～20ml调匀，将粪便混悬液经2层纱布（或100目金属筛网）过滤，离心（2000rpm/min）2分钟；倒去上层粪液，保留沉渣，加水10ml混匀，离心2分钟；倒去上液，加10％甲醛7ml。5分钟后加乙醚3ml，塞紧管口并充分摇匀，取下管口塞，离心2分钟，即可见管内自下而上分为4层。取管底沉渣涂片镜检。如检查原虫包囊，可加卢戈氏液染色，加盖片镜检。

⑵浮聚法：利用比重较大的液体，使原虫包囊或蠕虫卵上浮，集中于液体表面。常用的方法有两种：

1）饱和盐水浮聚法：此法用以检查钩虫卵效果最好。用竹签取黄豆粒大小的粪便置于浮聚瓶（高3.5cm，直径约2cm的圆形直筒瓶）中，加入少量饱和盐水调匀，再慢慢加入饱和盐水到液面略高于瓶口，但不溢出为止。此时在瓶口覆盖一载玻片，静置15分钟后，将载玻片提起并迅速翻转，镜检（图21－3）。

图21－3　饱和盐水浮聚法

饱和盐水配制：将食盐徐徐加入盛有沸水的容器内，不断搅动，直至食盐不再溶解为止。

2）硫酸锌离心浮聚法：此法可用于检查原虫包囊，球虫卵囊和蠕虫卵。取粪便约1g，加10～15倍的水，充分搅碎，按离心沉淀法过滤，反复离心3～4次，至水清为止，最后倒去上液，在沉渣中加入比重1.18的硫酸锌液（33％的溶液），调匀后再加硫酸锌溶液至距管口约1cm处，离心1分钟。用金属环取表面的粪液置于载玻片上，加碘液一滴，镜检。

3）蔗糖离心浮聚法：此法适用于检查粪便中隐孢子虫的卵囊。取粪便约5g，加水15～20ml，以260目尼龙袋或4层纱布过滤。取滤液离心5～10分钟，吸弃上清液，加蔗糖溶液（蔗糖500g，蒸馏水320ml，石炭酸6.5ml）再离心，然后如同饱和盐水浮聚法，取其表液膜镜检（高倍或油镜）。卵囊透明无色，囊壁光滑，内有一小暗点和发出淡黄色的子孢子。隐孢子虫的卵囊在漂浮液中浮力较大，常紧贴于盖片之下，但1小时后卵囊脱水变形不易辨认，故应立即镜检。也可用饱和硫酸锌溶液或饱和盐水替代蔗糖溶液。

常见蠕虫卵、包囊的比重如表21－1。

表21－1　蠕虫卵及包囊的比重

虫卵或包囊 比 重 华支睾吸虫卵 1.170～1.190 姜片吸虫卵 1.190 肝片形吸虫卵 1.200 日本血吸虫卵 1.200 带绦虫卵 1.140 微小膜壳绦虫卵 1.050