实验室环境和人体表面微生物的检查

实验一 实验室环境和人体表面微生物的检查

　　一、目的要求

　　1．证明实验室环境与体表存在微生物。

　　2．比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。

　　3．体会无菌操作的重要性。

　　二、基本原理

　　平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在37℃温度下培养，1—2天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。

　　三、器材

　　肉膏蛋白胨琼脂平板，无菌水，灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯或煤气灯，记号笔（或蜡笔），废物缸。

　　四、操作步骤

　　每组在“实验室”和“人体”两大部分中各选择一个内容做实验，或由教师指定分配，最后结果供全班讨论。

　　1．写标签

　　任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，培养皿的记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。用记号笔写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源（如实验室空气或无菌室空气或头发等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。

　　2．实验室细菌检查

　　（1）空气 将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。一小时后盖上两个皿盖。

　　（2）实验台和门的旋钮

　　（a）用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线，如图Ⅱ-1。

　　（b）取棉签 左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞（或试管帽），将其取出（图Ⅱ-2，B），将管口很快地通过煤气灯（或酒精灯）的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出（图Ⅱ-2，C）。放回棉塞（或试管帽）（图Ⅱ-2，D），并将空试管放在试管架上。

　　（c）弄湿棉签 左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞（或试管帽）并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞（或试管帽），并将灭菌水试管放在试管架上。

　　（d）取样 将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2平方厘米的范围。

　

　　（e）接种 按图Ⅱ-3，A在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下）（图Ⅱ-3，B），立即闭合皿盖。并按图Ⅱ-2，E和F，将原放棉签的空试管拔出棉塞（或试管帽），烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。

　　（f）划线 另取接种环在火焰上灭菌，如图Ⅱ-4，先将环端烧热（图Ⅱ-4，1），然后将接种环提起垂直放在火焰上（图Ⅱ-4，2），以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快地来回通过火焰数次（图Ⅱ-4，3）。

　　左手拿起平板，同样开启一缝，将灭过菌并冷却了的接种环（可在琼脂表面边缘空白处试温度，若发出溅泼声，表示太烫），通过琼脂顶端的接种区，向下划线，直到平板的一半处（图Ⅱ-3，C）。注意：接种环与琼脂表面的角度要小，移动的压力不能太大，否则会刺破琼脂。

　　闭合皿盖，左手将平板向左转动至空白处，右手拿的接种环再在火焰上烧灼，使冷。接种环通过前面划的线条再在琼脂的另一半，按图Ⅱ-3，D从上向下来回划线至1／2处。

　　烧灼接种环，转动平板，按图Ⅱ-3，E，划最后1／4，立刻盖上皿盖，烧灼接种环，放回原处。

　　整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。

　　3．人体细菌的检查

　　（1）手指（洗手前与洗手后）

　　（a）分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后（当然，班级、姓名、日期各项在每次写标签时是必不可少的）。

　　（b）移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。

　　（c）用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。

　　（2）头发 在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到琼脂平板表面，然后盖上皿盖。

　　（3）咳嗽 将去盖琼脂平板放在离口约6—8cm处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。

　　（4）鼻腔

　　（a）按照实验台检查法的步骤（b）和（c），取出棉签，并将其弄湿。

　　（b）用湿棉签在鼻腔内滚动数次。

　　（c）按实验台检查法的步骤（e）和（f），接种与划线，然后盖上皿盖。

　　4．将所有的琼脂平板翻转，使皿底在上，放37℃培养箱，培养1—2天。

　　5．结果记录方法

　　（1）菌落计数在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数。不是划线的平板，也一分为四，数1/4面积的菌落数。

　　（2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。

　　菌落特征描写方法如下：

　　（a）大小 大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。

　　（b）颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。

　　（c）干湿情况 干燥、湿润、粘稠。

　　（d）形态 圆形、不规则等。（e）高度扁平、隆起、凹下。

　　（f）透明程度 透明、半透明、不透明。

　　（g）边缘 整齐、不整齐。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　（1）将你自己的平板结果记录于下表中。

　　（2）与其他同学所做的结果进行比较。

　　2．思考题

　　（1）比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？

　　（2）人多的实验室与无菌室（或无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？

　　（3）洗手前后的手指平板，菌落数有无区别？

　　（4）通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？