细胞/组织裂解液

1. 溶液准备

2×样品缓冲液：130mM Tris-HCl （ pH8.0 ） , 20% （ v/v ） 甘油 , 4.6% （ w/v ） SDS , 0.02% 溴酚蓝 ,

2%DTT

PBS （ pH7.4 ） :10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4 ，50mM NaCl，2.7mM KCl

RIPA缓冲液：50mM Tris-HCl（pH7.4），150mM NaCl，1mM EDTA，1%Triton×100 ，1%去氧胆酸钠，0.1%SDS，1mM PMSF，1μg/ml 牛胰蛋白酶抑制剂 （ aprotinin ），1μg/ml亮抑蛋白酶肽 （ leupeptin ）

裂解液缓冲液：10mM Tris-HCl（pH7.4），0.15M NaCl，5mM EDTA（pH8.0），1%Triton×100；使用前加5mM DTT，0.1mM PMSF异丙醇和5mM ε-氨基己酸。

2. 裂解液的制备

A. 制备细胞裂解液：

①收集胰蛋白酶消化的细胞并离心，用PBS清洗。

②用100μl RIPA缓冲液冰浴溶解沉淀10min（每500000个细胞20μl RIPA缓冲液）。

③10000rpm，4℃离心10min，取上清转移至新管。

④用考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度。

⑤用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml,每小瓶中放100μl，-80℃储存。

⑥按照1:1体积比混合2×样品缓冲液，煮沸5min后，室温放置5min.

⑦短时离心后点样电泳检测。

B． 制备组织裂解液：

①在制备过程中一直将溶胞液或组织放在冰上。

②切开组织，称取组织1.5g于PBS中清洗。

③在RIPA缓冲液中剪碎组织后，转移到匀浆器中，加足5ml RIPA缓冲液，研磨20min.

④将研磨液转移到1.5ml的离心管中，14000rpm，4℃离心10min.

⑤取上清液作为完整的组织裂解液。

⑥用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。

⑦用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80℃储存。

⑧按照1:1体积比混合2×样品缓冲液，煮沸5min后，室温放置5min.

⑨短时离心后点样电泳检测。