酶标仪基本知识及其检测原理

光是电磁波，波长100nm-400nm称为紫外光，400nm-780nm之间的光可被人眼观察到，大子780nm称为红外光。人们只所以能够看到色彩，是因为光照射到物体上被物体反射回来。绿色植物之所以是绿色，是因为植物吸收了光中的红色光谱。酶标仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。

检测单位：

光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。

检测单位用OD值表示，OD是opticaldelnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，OD=10g（1/trans），其中trans为检测物的透光值。根据Bouger-amberT-beer法则，OD值与光强度成下述关系：

E=OD=logⅠ0/Ⅰ其中E表示被吸收的光密度，Ⅰ0为在检测物之前的光强度，Ⅰ为从被检测物出来的光强度。

OD值由下述公式计算：

E=OD=C×D×E

其中：C为检测物的浓度；D为检测物的厚度；E为摩尔因子。

在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长。

但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。

Anthos酶标仪检测值计算

仪器中的检测器接收透过被检测物的光能量，转换成二进位数字信号，最大为4095.仪器定义没有光源下的透光值为0%，没有检测物的透光值为100%。则实际检测中，检测物的透光值均在0%一100%之间。

透光值的计算如下：

T=（Meas-Min）/（Max-Min）

其中T为透光值，Meas为检测的二进位数值，Min为在0%的情况下检测的二进位数值，Max为在100%的情况下检测的二进位数值，举例如下：

Anthos酶标仪的中心定位

仪器会自动对酶标孔进行中心定位，中心定位是要消除酶标孔底的凸凹引起的厚薄不均带来检测的不准确。在对每一个酶标仪进行检测时，仪器其实要进行35个点的测量，选取最中间的5个点的均值为本孔的OD值。

光源的参照通道

参照通道是用来校准由于电压不稳或灯泡磨损带来的影响。

酶标仪的用途和其它提示

用于ELISA试剂的测定，广泛用于各种实验室，包括临床实验室。

质量控制

质量控制是试剂检测的重要因素。请按照试剂说明书的要求进行质量控制。

空白校正

有一些试剂盒的说阴书将空白孔设置为空气，其它大多数空白孔的设置是用试剂来设置的，请按照试剂盒的说明书要求进行。

检测结果的解释

由于有相当多的因素会影响检测的结果，如不同的酶标板，检测试剂的体积，都会造成OD值的不，因此，只有使用同一酶标板反应的试剂检测结果才能比较和分析。对结果的临床解释请依照试剂盒的说明书进行。

酶标仪的使用注意事项

1、工作环境

酶标仪是一种精密的光学仪器，因此良好的工作环境不仅能确保其准确性和稳定性，还能够延长其使用寿命。根据DINVDE0871条例，仪器应放置在无磁场和干扰电压的位置。依据DIN45635-19条例：

仪器应放置在低于40分贝的环境下。

为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。

操作时环境温度应在15℃-40℃之间，环境湿度在15%-85%之间。

操作电压应保持稳定。

操作环境空气清洁，避免水汽，烟尘。

保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够的操作空间。

2、操作注意事项

酶标仪的功能是用来读取酶联免疫试剂盒的反应结果，因此要得到准确结果，试剂盒的使用必须规范。许多医院在使用酶标仪之前是通过目测判断结果，操作过程随意性较大，在使用酶标仪后如果不能及时纠正操作习惯，会造成较大误差。在酶标仪的操作中应注意以下事项：

使用加液器加液，加液头不能混用。

洗板要洗干净。如果条件允许，使用洗板机洗板，避免交叉污染。

严格按照试剂盒的说明书操作，反应时间准确。

在测量过程中，请勿碰酶标板，以防酶标板传送时挤伤操作人员的手。

请勿将样品或试剂洒到仪器表面或内部，操作完成后请洗手。

如果使用的样品或试剂具有污染性、毒性和生物学危害，请严格按照试

剂盒的操作说明，以防对操作人员造成损害。

如果仪器接触过污染性或传染性物品，请进行清洗和消毒。

不要在测量过程中关闭电源。

对于因试剂盒问题造成的测量结果的偏差，应根据实际情况及时修改参数，以达到最佳效果。

使用后盖好防尘罩。

出现技术故障时应及时与厂家联系，切勿擅自拆卸酶标仪。

酶标仪及洗板机选购指南

酶标仪（MicroplateReader）是对酶联免疫检测（EIA）实验结果进行读取和分析的专业仪器。酶联免疫反应通过偶联在抗原或抗体上的酶催化显色底物进行的，反应结果以颜色显示，通过显色的深浅即吸光度值的大小就可以判断标本中待测抗体或抗原的浓度。

酶标仪广泛地应用在临床检验、生物学研究、农业科学、食品和环境科学中，特别在近几年中，由于大量的酶联免疫检测试剂盒的应用，使得酶标仪在生殖保健领域中应用越来越广泛，同时促进了生殖健康技术水平提高。

目前国内许多计生站系统开展了酶免检测项目，如：乙肝五项、爱滋病检测、优生优育系列检测、激素检测等。过去多数采用目测方法，报出的结果缺乏科学的依据。例如：某弓形虫检测试剂盒中，临界值规定为：阴性对照品的OD值×2.5,通过目测无法判断标本孔的反应颜色是否超过临界值。肉眼进行两孔之间的颜色比较可能还行，但比较一孔的颜色是否超过另一孔颜色的2.5倍就不可能。

国内多家权威机构，如卫生部临床检验中心和计划生育系统等多次强调酶标仪的重要性，并要求酶联免疫检测试剂应使用酶标仪判读，酶免试剂的质控也应使用酶标仪，并提供酶标仪测定的原始数据，而各厂家的试剂盒说明书没有是让用目测的。同时酶免检测的项目往往是一些实质性的感染和病变（如：肝炎、爱滋病、优生优育等），判读更要求严谨，由误诊引起的纠纷很难处理。另外，住院手术病人术前的丙肝、爱滋等EIA试剂检测是避免因输血引起感染引发的医疗事故纠纷的必要手段，正逐渐被许多单位所采用。

我国免疫诊断方法主要有如下三种：酶免（EIA）、放免（RIA）和发光，在市场上的情况如下：

各种方法所处市场周期：放免衰退期，酶免成长期，发光进入期。

放免技术由于试剂的污染和有效期等问题在国际和国内市场逐渐被淘汰，而化学发光试剂和设备比较昂贵，使得其在国内的普及特别在计生系统普及需要较长时间，EIA技术稳定，试剂价格合理，供应充，酶免技术在中国市场处于成长期，因此购买酶标仪正合适宜。

尤其要提到的是，在中国的计划生育和妇幼保健系统配备酶标仪已经迫在眉睫。早在几年以前，世界卫生组织已建议对孕妇进行TORCH五项常规筛查，但是遗憾的是由于缺乏酶标仪和洗板机等设备，RCH的检测在中国还未能普遍开展。TORCH感染在围产医学中称为TORCH综合症，由于孕妇，胎儿和新生儿都易被感染，它已受到全世界妇产科和儿科的极大重视。

妊娠期感染不仅危害母体，往往还可对胎儿和新生儿产生严重影响。通过胎盘可引起子宫内感染而导致流产、早产、死胎或胎儿生长迟缓和畸形，通过产道和母乳可引起新生儿感染。如累及神经系统可造成不同程度的智力障碍以及各种瘫痪、失聪ORCH感染与优生优育有极为重要的关系。因此，RCH（IgG和IgM）检查通常也称为优生优育十项检查。目前，TORCH的检测方法主要有放免（RIA）和酶免（EIA）。由于放免方法需要特殊仪器，且有放射危害，目前正被酶免（EIA）方法取代。EIA方法具有特异性强，灵敏度高，简单快速，成本低等优点，只要配备有酶标仪和其他相应的设备，多数普通实验室均可方便地开展。很显然，尽快在计生系统普及酶标仪等设备是一个迫切的需求。

这项工作的落实将有助于提高诊治水平，降低母婴发病率，从而提高整个国民的健康素质。目前市场上提供的EIA试剂越来越多，如：T3、T4、TSH、TORCH系列、不孕系列、各种癌症标志物、伤寒、副伤寒等，另外通过母婴传播的性传播疾病（如淋病、梅毒、HIV）和肝炎（如HBV、HCV），以及胎儿的抗体，新生儿TSH的测定，疫苗反应等，市场上也都有成套EIA试剂盒供应。使用酶标仪有利于拓展检测项目，提高检测水平，其社会效益和经济效益并举。

酶标仪的使用方法

作为微孔板比色计的酶标仪，其基本功能不外乎一个比色测定，所不同的是在测定波长范围、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量测定软件功能等方面的差异，当然全自动酶免疫分析系统还具有自动洗板、温育、加样等功能。在临床实验室实际工作中，实验人员在使用酶标仪进行测定操作时，有时难免会对酶标仪的一些性能指标产生迷惑，甚至对酶标仪的应用产生错误的理解。如诸如使用酶标仪较用肉眼观察测定的阳性率明显增加这样的问题。

一、测定波长    一般酶标仪的测定波长在400~750nm或800nm之间，完全可以满足ELISA的显色测定。目前国内常见的ELISA试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶（HRP），底物通常为四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD），其在过氧化氢溶液的存在下，经HRP作用，分别氧化为2,2,-二氨基偶氮苯（DAB）和联苯醌。当pH值为5.0左右时，DAB在450nm波长处有最大吸收，当pH值降为L 0时，最大吸收波长移至492 nm,同时摩尔消光系数变大，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，H:O:和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH,即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min.因此，450nm和492 nm两个波长是目前ELISA测定最常用的。各种酶标仪都配有放置滤光片的可自动转换的部件，可以同时安装6~8片滤光片，所配备的滤光片均应包括上述两个波长，有的酶标仪以490nm滤光片替代492nm滤光片，影响不大。除了这两个基本滤光片外，考虑到双波长比色的需要，还应有620nm或630nm或650nm和405nm波长的滤光片，其他滤光片可根据自己的需要选择。有时，有的实验室希望用酶标仪作微量生化测定，故酶标仪生产厂家对其生产的酶标仪扩展了紫外检测功能，此时需要一个340nm波长滤光片。此时，酶标仪的测定波长范围就成为340-750nm或800nm。

酶标仪有单波长和双波长检测功能有时使用者不知在什么情况下使用单或双波长检测。所谓的“单波长”就是使用一种对显色具最大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定；而“双波长”则除了用对显色具最大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630 nm进行测定，酶标仪最后打印出来的吸光度则为二者之差。630 nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板子上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白孔。

二、测定的吸光度范围   

通常，酶标仪的吸光度测定范围在。0-2.5之间即可以满足ELISA的测定要求。早期的酶标仪可测定的吸光度一般在0-2.5之间，但现在基本上都做了拓宽，可达到3.5以上，并且能保持很好的精密度与线性。如Labsystems公司Dragon Wellscan MK-2的吸光度测定范围为0-3.5，而Multiskan Ascent的吸光度测定范围（Abs）达0-4.0，在0-4.0范围，线性误差不超过±2.0%，在0.3-3.0吸光度范围内，测定精密度CV小于±0.2%；3.0-4.0 Abs范围内，测定精密度CV小于士0.2%。因此，对于酶标仪的吸光度范围不必去刻意追求大的吸光度范围，主要要看在一定的吸光度范围内的线性和精密度如何。

三、光学系统   

酶标仪的光学系统采用的是垂直光路多通道（通常为8或12通道，亦有单通道）检测，一般为硅光管或光导纤维，除测定通道外，有的酶标仪还有一个参比通道，每次测定可进行自我校准。酶标仪的光学系统功能如何，均可通过酶标仪测定的吸光度范围、线性度、精密度和准确度等体现出来。光学系统好的话，则上述指标也应较佳。测定的精密度与测定通道之间的均一性有直接关系。单通道可避免因通道不同所致的差异。

四、检测速度   

酶标仪的检测速度是指其完成比色测定所需要的时间。检测速度快，有利于提高检测的精密度，即避免由于测定过程中，因测定时间不同所致的各微孔间吸光度间的差异。目前市场上常见的酶标仪检测速度都非常快，通常在数秒钟内，如Labsystems公司Dragon Wellscan MK-2和MK-3检测96孔只需2s（连续模式）或5s（步进模式）。Multiskan Ascent为单通道检测，亦只需9s（连续模式）或14s（步进模式）。又如BioRad公司的Benchmark的检测速度单波长为7s，双波长为15s。

五、震板功能   

酶标仪的震板功能是指酶标仪在对ELISA板孔进行比色测定前对其进行振荡混匀，使板孔内颜色均一。目前市场上常见的酶标仪均有震板功能，所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋转等方式及振荡幅度等任意调节，如Labsystems的MK-2；有的则较为固定，如BioRad 550。使用有震板功能的酶标仪，在进行ELISA测定显色反应完成加入终止剂后，可不必振荡混匀，直接放人酶标仪上测定即可。

六、温育功能   

温育功能是指酶标仪本身能按要求自动精确地控制仪器内部的温度，使得ELISA测定中微孔板条的温育过程可在仪器内部完成，而无需再外配温箱。目前，只有少部分酶标仪具有此种功能，如Labsystems公司的Multiskan Ascent，BioRad公司的Benchmark和Biotek公司的ElxS08等。温育功能只是酶标仪的一个附加功能，是否具有并不能说明酶标仪档次的高低及仪器的优劣。作为实验室是否选择，则可根据自己实验室的条件及需要来决定。

七、软件功能   

软件功能是指酶标仪所具有的对ELISA定性和定量测定及其他测定方式如酶标动力学、紫外和凝集等数据的统计分析并报告结果的功能。软件功能是中高档酶标仪的一个非常重要的功能。如果硬件方面区别不大，则软件就成为判定酶标仪优劣的惟一指标。对于用户来说，好的软件功能，对实际工作会有较大的帮助。ELISA定性测定，酶标仪如具有阳性判断值（cut-off）及其测定“灰区”（即指测定吸光度处于cut-off周围的一定区域，此区域内结果应为“可疑”）的统计计算功能，不但方便了实验室工作人员，而且在某些特定的情况下，有很高的实用价值。如血站实验室为筛检献血员血进行HBsAg、抗HCV和抗HIV等的ELISA测定时，常会遇到测定吸光度处于cut-off附近但又低于cut-off的血，按照试剂盒的标准，可判为阴性，血为合格血，可用于患者输血，但直觉告诉我们，这样的血如输给患者，导致输血后相应疾病发生的可能性较大，这是由ELISA现有的测定技术的不确定性所造成的，也就是ELISA测定的“灰区”的存在使得ELISA测定试剂盒cut-off的设定只是相对的准确，此时的假阳性和假阴性出现的可能性较低。因此，在血站筛检献血员血时，如以测定“灰区”的下限作为判断献血员血筛检不合格标准，就可以避免因“灰区”所致结果判断错误而引起输血后疾病发生的可能性。合适的软件功能对于ELISA定量测定同样很重要。有研究表明，四参数方程能较好地反映免疫测定的剂量反应曲线，最为适合于定量酶免疫测定的曲线拟合。因此，如目的是定量测定，则在酶标仪的软件功能中，最好要有这种曲线回归方程计算分析功能。其他诸如连点、直线等回归计算，则可根据酶标仪的应用目的而定，如兼用于微量生化测定，则此类回归计算就很有必要。

此外，酶标仪兼做酶标动力学、凝集反应测定所需的软件是否应具备，当然也应根据使用目的而定。由于此类软件一般都较为昂贵，酶标仪常另外单独按需配备，如果不是实验室特殊需要，就不必强求这种软件功能。

八、语言界面   

通常进口的中高档酶标仪人机对话多采用英文。这对于某些基层实验室可能会存在语言方面的困难，从而难以最大限度地发挥酶标仪的作用。为解决这方面的问题，已有一些酶标仪采用了中文界面，如Labsystems的MK-3。这样就大大方便了广大基层实验室技术人员的使用。

综上所述，尽管酶标仪的发展极为快速，种类繁多，功能也不断加强，但其最根本的功用是不变的，即比色测定。大凡比色测定，其基本要求就是在一定吸光度范围内要有好的测定准确性、线性和精密性。同样的吸光度范围，测定的准确性、线性和精密性越好则酶标仪亦越佳。

而且，由于用于酶标仪比色测定的为多孔（通常为96孔）微孔板条，为保证测定的孔间重复性，则测定速度也是一个较重要的性能指标。至于其他如震板、温育及有关的软件功能，则可根据各自实验室的需要去比较选择。