凝胶阻滞

一、原理

电泳迁移率分析，也可称作迁移电泳，凝胶电泳分析，凝胶迁移率分析，条带移动分析或者凝胶阻滞分析，这种方法常用来研究蛋白质-DNA，蛋白质-RNA的相互作用，对照泳道（不含蛋白质的DNA/RNA探针）将出现单一的条带。如果蛋白质与片段结合，形成大的复合物，因此在凝胶上迁移的速度慢从来迁移率减低。

二、材料和试剂

1. DTT（Promega）

2. poly-dIdC（Sigma）

3. 32P-labeledprobe

4. BSA（Sigma）

5. 常用化学品试剂（Sigma）

6. 滤纸（GEHeathcare）

三、步骤

1. 制备聚丙烯酰胺凝胶

（1）装配板，垫片，及夹具。用1%琼脂糖封闭底部与侧面，防止胶漏。

（2）5%聚丙烯酰胺凝胶的制备

Platesize	Large	Medium
H2O	78 mL	39 mL
10×TBE	5 mL	2.5 mL
30%丙烯酰胺（19：1）	16.6 mL	8.4 mL
10%过硫酸铵	1000 uL	500 uL

（3）混匀，尽量减少泡沫的形成。加100 uL/50 uLTEMED。
（4）混匀后倒入胶板，插梳子。凝胶聚合大概需10分钟。
（5）聚合后，凝胶可用塑料膜包裹后4℃保存。

2. 制备5×结合缓冲液。

3. 结合反应

1 uL poly-dIdC（1ug/uLinTE）

2 uL 5x结合缓冲液

1 uL 标记探针

如有必要加1uL未标记的DNA探针片段（如竞争试验）

0.1 uL 100xBSA

若干体积（uL）的核提取物（5ug总蛋白）

加H2O到10 uL 总体积

室温孵育30分钟。如有必要可再加入蛋白抗体，使阻滞更加明显，加抗体后再室温孵育30分钟。

4. 在结合反应孵育的过程中，将胶装在电泳槽，在0.5×TBE电泳缓冲液，150伏电压下，预跑30分钟，之后上样，150 V 电泳2小时。

5. 制干胶（可选）：将胶转移到滤纸上。胶上盖滤纸，80℃真空干燥器中干燥1-2小时。

6. 压片曝光在暗室中将胶放在暗盒中，放胶片。在-80℃条件下曝光。