D-半乳糖致衰老模型小鼠皮肤衰老的观察

[摘要] 目的 观察D-半乳糖连续皮下注射对小鼠皮肤衰老指标的影响。 方法 3月龄KM雌性小鼠60只,随机分为空白对照组(注射生理盐水)、D-半乳糖低剂量组(80mg/kg)和D-半乳糖高剂量组(1000mg/kg),连续每日背部皮下注射42天后,观察小鼠皮肤中与衰老相关的生化指标及组织病理学变化,并用计算机图像分析系统定量分析。 结果 　高剂量组小鼠真皮厚度〔(624.5±48.5)μm〕较对照组〔(839.3±58.4)μm〕显著变薄(P<0.05),胶原纤维减少,排列疏松,弹力纤维总面积亦显著减少(P<0.05);高剂量组皮肤中超氧化物歧化酶(SOD)活性〔(131.2±11.5) U/ml〕、羟脯氨酸含量〔(0.57±0.13)μg/mg〕显著低于对照组的〔(178.1±20.7) U/ml、(0.74±0.17)μg /mg,P<0.05〕,丙二醛(MDA)含量增加〔(9.4±1.5)nmol/g和(6.8±1.5)nmol/g,P<0.05〕;而低剂量组上述改变则不显著。 结论 　每日1000mg/kg D-半乳糖连续皮下注射42天,可导致小鼠皮肤的明显衰老,为抗皮肤衰老研究提供一个简便、稳定的实验模型。

衰老是生物体在生命周期中随年龄增长而发生的全身组织、器官功能减退和稳态下降的过程。随着世界人口加速老龄化,抗衰老研究已成为迅速崛起的一门应用科学。若在人体上进行这一漫长衰老过程的研究及对抗衰老药物进行疗效观察是不易做到的,因此,人们根据衰老的机制建立了许多动物衰老模型。目前,应用最多的是D-半乳糖所致的亚急性衰老模型,它可引起心、肝、肾、脑等重要器官的代谢异常,类似人类自然衰老时的表现 [1] 。我们于2003年1~6月采用KM雌性小鼠连续皮下注射D-半乳糖,建立小鼠亚急性衰老模型,观察衰老小鼠皮肤中与衰老相关的生化指标及组织病理学变化,为皮肤抗衰老研究提供实验工具。

材料和方法

一、材料与仪器

1.实验动物 :选用3月龄清洁级KM雌性小鼠60只(广东医学院实验动物中心提供),平均体重(30±2)g,标准饲料饲养。

2.实验仪器 :AE-240型电子分析天平(上海Mettler-Toledo仪器有限公司),JB-2型恒温磁力搅拌器(上海雷磁仪器厂),SHHW21.600三用电热恒温水浴箱子(天津市华北实验仪器有限公司),DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱子(上海医用恒温设备厂),752型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂),内切式组织匀浆机(浙西机械厂);55P-72超速离心机(日本Hitacht公司);计算机图象数字化分析系统(德国LEICA公司)。

3.主要试剂 :D-半乳糖(上海试剂二厂);盐酸苄胺(上海试剂厂);硫代巴比妥酸(TBA,美国Sigma公司);四乙二氧基丙烷(瑞士Fluka公司);L-羟脯氨酸(中科院上海生化所);DTNB(德国Feinbiochemica公司);超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物科技公司);考马斯亮蓝G250(瑞士Fluka公司);其余试剂均为市售分析纯。

二、实验方法

1.动物分组、给药及处理 :动物随机分为3组:空白对照组、D-半乳糖低剂量组和D-半乳糖高剂量组,每组20只。对照组:每日背部皮下注射生理盐水0·2 ml。低剂量组:每日背部皮下注射D-半乳糖80 mg/kg;高剂量组:每日背部皮下注射D-半乳糖1000 mg/kg,注射均按无菌操作进行。42天后,所有小鼠摘眼球放血处死,立即检测全血中过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力;取背部正中皮肤0.5 cm×0.5 cm大小,迅速放入10%中性福尔马林液中固定,拟作组织切片进行组织形态学观察及定量分析;余背部皮肤取下后迅速冰冻保存,拟作皮肤组织匀浆及测定皮肤羟脯氨酸之用。

2.10%皮肤匀浆的制备 :取脱毛背部皮肤组织0.5 g,经预冷生理盐水漂洗,除去皮下脂肪和其它结缔组织,滤纸拭干,称重,量筒量取该组织块9倍重量预冷生理盐水,用内切式组织匀浆机制成10%组织匀浆(在冰水中),反复冻融3次,使细胞完全破碎,内容物全部游离在液相中。

3.全血CAT及GSH-Px活力测定 :取新鲜30% H2O2液0.5 ml加蒸馏水50 ml混匀,从中取出4 ml,加入pH7.0的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液26 ml,紫外分光光度计测定其230 nm波长处1 cm光路A值,调节A值在0.50~0.55之间,作为CAT底物液。25℃条件下,取底物液3 ml,迅速加入1:50溶血液0.01 ml,230 nm波长处立即测定其A值,1min后再测其A值,同时测定蛋白质含量。GSH-Px活力测定参照南京建成生物工程公司GSH-Px试剂盒说明书方法测定。

4.组织切片染色法 :参考文献(2)。弹力纤维染色采用Weigert's间苯二酚品红法;胶原纤维染色采用Mallory-Heidenhain's改良法。

5.皮肤生化指标的测定 :参照南京建成生物工程公司SOD试剂盒说明书方法测定SOD活力;皮肤中丙二醛(MDA)含量测定、皮肤CAT活力测定、皮肤羟脯氨酸含量测定参见文献(3)。

三、统计学处理

数据采用均数±标准差表示,组间比较采用t检验。

结 果

一、全血CAT、GSH-Px活力检测结果

见表1。高剂量组血中CAT、GSH-Px活力较对照组显著降低,差异有显著性(P<0.05);而低剂量组改变不显著。

二、皮肤组织病理学形态观察及定量分析

见表2及图1~6。与对照组比较,高剂量组小鼠真皮显著变薄,细胞层数减少,真皮胶原纤维排列疏松;弹力纤维总面积显著减少,且增粗、变性、堆积。计算机图像定量分析,差异均有显著性,而表皮厚度改变不明显。低剂量组皮肤组织形态学改变不明显。

三、小鼠皮肤生化指标检测结果

与对照组相比,高剂量组小鼠皮肤中SOD活力明显降低,MDA含量显著增多,而皮肤CAT活力检测结果因各组标准差太大,无统计学意义;低剂量组皮肤组织生化指标改变不明显,见表3。

讨　　论

D-半乳糖所致的亚急性衰老模型系在一定时间内通过皮下连续注射D-半乳糖,使机体细胞内半乳糖浓度增高,在醛糖还原酶催化下,还原成半乳糖醇,该物质不能在细胞内进一步代谢而堆积,影响细胞正常渗透压,导致细胞代谢紊乱,自由基堆积,造成细胞损伤〔3〕;又由于糖代谢在三大物质代谢中具有重要作用,糖代谢的紊乱进而影响到蛋白质、脂质的代谢,也影响到细胞内抗氧化酶的合成,从而使细胞清除自由基的能力下降,细胞发生一系列退行性变化,呈现衰老状态 [4] 。如青年鼠造模后,某些衰老指标检测可达21月龄的自然衰老小鼠的衰老程度 [1,5] 。

本实验结果显示,小鼠每日D-半乳糖(1000mg/kg)连续皮下注射42天可导致小鼠皮肤细胞代谢紊乱,皮肤SOD活性明显降低,提示皮肤自由基防护功能下降;皮肤MDA含量较对照组显著增多,表明脂质过氧化产物堆积;而皮肤羟脯氨酸含量较对照减少,表明小鼠皮肤胶原蛋白含量减少,皮肤趋于老化;皮肤CAT活力检测结果因各组标准差太大,不宜作为皮肤抗衰老指标。

皮肤组织学显示,小鼠皮肤真皮层显著变薄,胶原纤维减少,排列疏松,弹力纤维变性、堆积,皮肤处于衰老状态,该模型简便易行,结果稳定可靠,可作为抗皮肤衰老研究中皮肤衰老的实验模型。

参　考　文　献

1 李文彬,韦丰,范明,等.D-半乳糖在小鼠上诱导的拟老化效应.中国药理学与毒理学杂志,1995,9:93-95.

2 刘培辉,主编.病理染色技术.第2版.北京:人民卫生出版社,2000. 56-61.

3 徐叔云,陈修,主编·药理实验方法学.第3版·北京:人民卫生出版社,2002.1464-1472.

4 Chung JH, Seo JY, Choi HR, et al·Modulation of skin collagen metabolism in aged and photoaged human skin in vivo.J Invest Dermatol,2001,117:1218-1224.

5 Frolkis VV.Aging, anti-aging, ontogenesis and periods of age development.Gerontology,1999,45:227-232.