引物溶解稀释方法

在实验室进行分子克隆实验时，经常需要合成大量的引物，而这些合成的引物首先要进行适当的稀释才能使用。如果不稀释就使用引物，往往造成引物的浪费和过早的活性丧失，更有一些被污染而不能使用。

因此，建议对合成的引物先进行稀释，然后使用。稀释的引物利于保存和应用。

现将方法简单叙述如下：

1. Oligo DNA是以OD260单位来计算的，这是指在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1A260的Oligo溶液定义为1 OD260单位，根据此定义，1 OD260单位相当于33μg的Oligo DNA，您可以根据此数据和您的Oligo DNA分子量，计算得到摩尔数以计算不同摩尔浓度的溶液。

2. 引物序列的分子量计算公式如下：

MW=（A碱基数×312）+（C碱基数×288）+（G碱基数×328）+（T碱基数×303）-61

例如：引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG A=1 C=3 G=11 T=6

MW=（1×312）+（3×328）+（6×303）-61=6541

3. Oligo DNA的分子量也可以用以下近似方法计算：Oligo DNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5，则一条Oligo DNA的分子量=碱基数×324.5。

例：

您得到一管标为5 OD260的20 mer Oligo DNA

分子量=20×324.5=6490

质量数=5×33=165μg

摩尔数=165/6490=0.025μmol=25nmol

若加灭菌双蒸水400μl溶解，则浓度为25nmol/400μl=62.5μM

4. 装有引物的eppendorf管一般保存于-20℃，临用前稀释。

5. 由于Oligo DNA呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管子前请先离心10,000rpm,1min,然后再慢慢打开管盖。

6. 在装有引物的eppendorf管内加入100-500μl双蒸水，盖上管盖，充分上下振荡5-10分钟，再次离心10,000rpm,1min。

7. 计算原引物管primer的浓度（必要时测OD260核对厂家提供引物量是否正确）。

8. 计算并将应用primer稀释为10pmol/μl。

9. 标明原引物管、应用引物管、稀释方法，置-20℃保存。