怎么鉴别引物二聚体和产物
互联网
10254
PCR可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后,我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析,也可以通过对光密度扫描来进半定量的分析。无论定性还是半定量分析,分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下,我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。
例如我们想知道某一特定基因在特定组织中的表达量。早期定量PCR技术需要特别的训练,严格的测试和特别准确的加样。早期定量PCR技术的难点主要在于:如何确定PCR正处于线性扩增范围内(只有在此范围内PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例),为了保证线性,研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整;在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
所谓的实时荧光定量PCR,其反应体系中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线。
例如我们想知道某一特定基因在特定组织中的表达量。早期定量PCR技术需要特别的训练,严格的测试和特别准确的加样。早期定量PCR技术的难点主要在于:如何确定PCR正处于线性扩增范围内(只有在此范围内PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例),为了保证线性,研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整;在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
所谓的实时荧光定量PCR,其反应体系中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线。
一般而言,荧光扩增曲线可以分三个阶段:荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,我们无法判断产物量的变化。
而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便,在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念:荧光阈值和CT值。
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值(thresholdvalue)。
而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便,在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念:荧光阈值和CT值。
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值(thresholdvalue)。
定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底的位置上,这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。对某一样品的C(t)值就定义为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数。
CT值与起始模板的关系研究表明,每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表CT值,纵坐标代表起始拷贝数的对数。
因些只要获得未知样品的CT值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
因些只要获得未知样品的CT值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。