胶体电泳法方法步骤

SDS 平板胶片铸造︰

1） 整理出两组玻璃片及白板铸胶组合，先用酒精拭净，并选择合适的间隔条（0.75 mm） 组合起来。请熟悉铸胶三明治组合的正确组装方式，以免灌入的胶液漏出来。

2） 三明治组合后直立站好，准备所要浓度的SDS 胶体溶液如表4.2. 两片0.75mm 厚的平板胶片约需10 mL 分离胶体溶液，以及5 mL 焦集胶体溶液。APS液到最后才加入，未加APS 以前可在真空中抽去溶液中的气体。

配制两片0.75 mm 胶片所需胶体 （mL）

3） 以上分离胶体各成份在小烧杯中混合均匀后，可直接沿着玻璃一侧倒入铸胶组合到预定高度 （约八成高），勿陷住气泡；再轻轻加上一层isopropanol. 也可使用滴管慢慢加入胶体，同样勿注入气泡。

4） 约30 min 可凝结，以滤纸吸去isopropanol,同法倒入焦集胶体溶液，要加到满；尽快插入样品槽齿模，注意不可有气泡陷在胶体中。一般在凝胶完成后，胶体与所加的水层的间，会出现清楚的直线界面，但因为背景为白色，较不易观察的。

5） 再度凝结后取下齿模即可使用。若不立刻使用，则把整个胶片组合用保鲜膜包好，胶面上方加一水层，勿使干掉，在4℃约可放1~2 周。

电泳方法︰

6） 若胶片组合保存于4℃，则要等待胶片完全回复室温，才架到电泳槽。胶片一定要完全回温，否则在进行电泳时，玻璃会因热胀而破裂。

7） 取F液稀释成一倍溶液，并加SDS成为0.1%;先倒入下方的正极槽，注意不可有气泡黏在胶体，然后倒入上方的负极槽。用微量针筒或微量移液器一个一个清洗样本槽，除去残留在槽内的胶体 （刷牙）。刷牙的动作很重要，而且要彻底，否则注入样本时，会有大麻烦。又因为白色氧化铝板乃白色背景，不容易看出样本槽的位置，可用Hoefer 所附的透明样本槽位置模板，作为指引，顺便可练习样本添加的动作。

8） 取蛋白质样本溶液，加入同体积E 液，以及适量追踪染料bromophenol blue,混匀后在100℃加热10 min.放冷短暂离心后即可依次以微量移液器注入样本槽，样本体积可自斟酌，但要记好位置及体积；通常都使用5~15uL.注入样本时，尽量把针头或吸管伸到样本槽底部，但不要触到样本槽底的胶面，则可以使得样本所占的体积最小，分离效果较好。

9） 装上电源盖，以100~150 V进行电泳，最高可加至200 V,视实验的紧急程度，以及胶片发热的情形而定。通电后两极附近会立刻产生无数细微气泡，是通电的特征。

10） 追踪染料很快进入胶体，开始焦集成蓝色细线，并向下泳动，大约1 h 可泳动到底边，中止电泳，除去电源盖。有些分子量较大的样本，或使用浓度较高的胶片，可以等到蓝色细线泳出胶体才停止。

胶片染色法：

11） 取出胶片组合，使玻璃板向上，先除去两侧间隔条，再以扁形药匙轻轻撬起玻璃，胶片则留在白板上。切除焦集胶体，并在分离胶片的右上方截角做记号 （区别胶片的左右）。

12） 取染色盘 （大约比胶片稍大），倒入CBR染色液，在染色盘上方把上述白板倒翻过来，挑起胶片一角，利用重力使胶片掉落到染色缸中。若要进行蛋白质转印，则胶片不能染色，要浸入转印缓冲液中。

13） 在CBR 中染色约30 min,染色盘要加密盖，置于旋转平台慢速50 rpm 摇荡的；要注意胶片是否完全没入染色液中，否则会造成染色不均匀。

14） 染色后小心把CBR 染剂倒回原来瓶中，整块胶片变成蓝色，先用自来水洗掉残余的染色液，再倒入约20 mL 脱色液，加密盖后再放回旋转平台摇荡。染色脱色过程请戴手套，否则会在胶片上留下指纹。

15） 胶片的蓝色背景渐渐脱掉，待脱色液转成蓝色后，可以换新脱色液；如此脱色数次，在一小时内应可看到蛋白质的蓝色色带出现。用过的脱色液，请回收倒在有机溶液的废液桶中。

16） 待胶片背景完全透明后，染色脱色完成。倒去脱色液，改用50%甲醇液洗一两次，待胶片缩至大约原来的尺寸，则可准备干燥的。

胶片干燥法：

17） 把玻璃纸cellophane 先用水浸湿，平铺在干燥用的玻璃片上，玻璃纸会比玻璃片大，因此四周有多出来的部份。

18） 把胶片平铺在玻璃纸中央，胶片与玻璃纸间不要有任何气泡。 除了气泡的外，若胶片没有回复原来的大小，或者胶片的四边有伤痕，都很容易造成胶片干燥后的龟裂现象。

19） 在胶片上再加一层浸湿的玻璃纸，也不要陷有气泡在内；把玻璃纸多出来的部份反折到玻璃背面，用手抹平表面水份，并用纸巾吸干。

20） 把此干片三明治组合放在桌上，次日即可得到已经干燥好的胶片，用电风扇或冷气机吹的，可以加快干片速度。 干片后用指甲尖轻敲胶片，若还可以看到指甲所留下的痕迹，表示胶片并未完全干燥，要再等候。

21） 待胶片完全干燥后，以美工刀或剪刀去除多余的玻璃纸，再加以护贝，则可永久保存的。免疫染色的转印纸，也可以护贝保存。