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肝脏细胞RNA的提取

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一.原理

RNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分,也是功能基因组 学科研技术的重要基础。从RNA水平研究生物体内基因的调控机制,已成为分子生物学研究的一个重要手段。对某一生物或组织进行性状研究,首先要获得该性状基因,从组织细胞中分离完整的RNA对于分子克隆 和基因表达分析等实验是至关重要的,如Northern印迹及杂交分析、cDNA合成等实验的成效在很大程度上取决于RNA的质量。利用提取的RNA人们可以对特定的基因表达进行定量的检测,从分子水平精确的了解细胞生命活动的规律。通常一个典型的哺乳动物细胞约含有10-5μgRNA ,其中80%~85%为rRNA(主要是28S、18 S和5.8 S、5S四种类型);10%~15%为tRNA和核内小分子RNA。

这些高峰度的RNA的大小和序列确定,可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析(HPLC)分离。相反,占RNA总量1%~5%的为mRNA 。mRNA 虽然大小和核苷酸序列各不相同,从数百至数千碱基不等,但大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一寡聚腺苷酸(polyA)组成的尾,其长度一般足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸―纤维素[oligo(dT)] ,使得mRNA可以利用亲和层析法分离。

这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽。研究表明RNA极不稳定,易于降解,而RNA酶几乎无处不在,且特别稳定,故在提取RNA时关键因素是最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制内源RNA酶的活力,因此,创造一个无RNA酶的环境,严格防止RNA酶污染是成功提取RNA的关键。

对内源性RNA酶,主要运用RNA酶抑制剂,目前常用的RNA酶抑制剂有:

①RNA酶的蛋白质抑制剂(RNasin),它是从人胎盘分离的一种蛋白质,可以与多种RNA酶紧密结合形成非共价结合的复合物,使RNA酶失活。RNA酶的蛋白质抑制剂制品经数次冻融后或放在氧化条件下应弃之不用。RNA酶的蛋白质抑制剂不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译;

②氧钒核糖核苷复合物,它是由氧钒离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物,是一种过渡态似物,它能与多种RNA酶结合并高效抑制RNA酶活性。然而氧钒核糖核苷复合物能强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译,因此必须用含0.1%羟基喹啉的苯酚多次抽提以除之;

③硅藻土,硅藻土能吸附RNA酶,并且在后续的RNA纯化过程中经离心除去;

④异硫氰酸胍,它是强力的蛋白质变性剂,在破坏细胞结构使核酸从细胞核中解离出来的同时也使RNA酶变性失活;

⑤焦碳酸二乙酯(DEPC),它是RNA酶强烈抑制剂,但其作用并不是绝对的。DEPC主要用于不能高压灭菌的材料和器皿的RNA酶处理;

⑥其它化学试剂,如SDS、尿素等对RNA 酶也有一定的抑制作用。

对外源性RNA酶主要通过以下几个途径污染RNA制品:

①玻璃制品、塑料制品和电泳槽;

②研究人员造成的污染;

③污染的溶液。

因此在实验中必须采取下列措施抑制外源性RNA酶:

①实验室用的普通玻璃制品和塑料制品经常有RNA酶污染,使用前必须于180℃干烤3h以上(玻璃制品)或用氯仿冲洗(塑料制品)。另一种方法是用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h,然后用灭菌水淋洗数次,并于100℃干烤15min。RNA电泳槽需用去污剂洗涤,用水冲洗,乙醇干燥,再浸泡于3%H2O2溶液10min,然后用0.1%DEPC水彻底冲洗电泳槽。灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶,可以不需要处理;

②在RNA提取过程中,应戴一次性手套,对接触可能污染的器皿时,应勤换手套;

③配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC水在37℃处理12h以上,然后高压灭菌除去残留的DEPC。对不能高压灭菌的试剂,用经DEPC水配制处理过的无菌蒸馏水配制,然后用0.22μm滤膜过滤除菌。

真核细胞总RNA 制备方法有多种,包括异硫氰酸胍—氯化铯超速离心法、盐酸胍—有机溶剂法、氯化锂—尿素法以及热酚法、异硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法以及TRIzol试剂提取法等。目前实验室提取总RNA的常用方法为异硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法和TRIzol试剂提取法。异硫氰酸胍法制备真核细胞总RNA,是将已知最强的RNase酶抑制剂异硫氰酸胍、β-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用,抑制了RNA的降解,增强了核蛋白复合物的解离,使RNA和蛋白质分离并进入溶液,RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相,容易被异丙醇沉淀浓缩。


二. 材料与方法

1 材料

实验鱼,购于市场。

2 仪器、用具

台式离心机、恒温水浴锅(70℃)、分析天平、移液器、一次性注射器、方盘、镊子、手术剪、培养皿、1.5ml离心管。

3试剂

95%的RNase-free乙醇;0.1%DEPC处理水;SV RNA Lysis Buffer;SV RNA dilution Buffer;SV RNA Wash Solution;Yellow core Buffer;MnCl2  ;0.09M;DNase Ⅰ;SV DNase Stop Solution;Nuclease-Free water。

4 方法

1) 材料的准备

(1) 将培养皿、剪刀、眼科镊灭菌,-20℃预冷。

(2) 用泡沫盒盛装碎冰,将培养皿置于冰上,将剪刀、镊子置于培养皿中。

(3) 用桶盛装碎冰,加入少量的自来水,用纱布包裹鱼放入桶中。

(4) 将已麻痹的鱼置于方盘中,用剪于肛门向前及斜向上将腹腔剪开,取出内脏,分离肝脏置于培养皿中。

(5) 取1.5ml的离心管于分析天平上,调零。

(6) 用镊子取20-30mg的肝脏组织于1.5ml的离心管中,称重。

2) 实验操作

(1) 取约30mg组织于1.5ml 离心管中,加入175μl SV RNA Lysis Buffer,用一次性注射器将组织压碎、反复抽打混匀。

(2) 加350μl SV RNA Dilution Buffer(蓝色),翻转管子3-4 次混匀,置70℃水浴3min。

(3) 冰上冷却1-2秒,14000rpm离心10min,上清液移入一新离心管。

(4) 加入200μl 95%的乙醇,枪头混匀。

(5) 将上述混合液移入Spin Basket Assembly,14000rpm离心1min,弃滤液。

(6) 加入600μl SV RNA Wash Solution(with ethand added),14000rpm离心1min,弃滤液。

(7) 在一新离心管中配制DNase incubation mix:

Yellow Core Buffer    40μl

MnCl2 0.09M     5μl

DNase Ⅰ     5μl

(8) 将上述50μl混合液直接加在Spin Basket的膜上,室温(20-25℃)保育15min。

(9) 加200μl SV DNase Stop Solution(with ethand added)至Spin Basket 14000rpm,离心1min。

(10) 加600μl SV RNA Wash Solution,14000rpm离心1min,弃滤液。

Yellow core Buffer 40μl    MnCl2,0.09M 5μl   DNase I 5μl

(11) 加250μl SV RNA Wash Solution,14000rpm离心2min,将Spin Basket转移到一新离心管中。

(12) 加50μl Nuclease-Free Water 至膜上,14000rpm离心1min,溶解RNA,-20℃保存。

(13) 取5μl RNA样品,1 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

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