还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的测定

GSH和GSSG 参照 Anderson等 （1992）。取0.5 g样品，加入3 mL冰冷的6%的偏磷酸（含1 mmol•L-1 EDTA ， pH 2.8），冰浴研磨，匀浆液以20,000 g，4 ℃离心15 min，取上清液来马上测定GSH和GSSG的含量或储存在-20 ℃下等待测定。总的GSH和GSSG含量测定如下：200 μL提取液加 1.2 mL反应液包含400 μL反应液1（110 mmol•L-1 Na2HPO4•7H20， 40 mmol•L-1 NaH2PO4•H2O， 15 mmol•L-1EDTA， 0.3 mmol•L-1 5,5‘-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid） DTNB， 0.04% BSA）、320 μL反应液2 （1 mmol•L-1 EDTA， 50 mmol•L-1 imidazole 咪唑solution and 0.02% BSA）、 400 μL反应液3（5% Na2HPO4， pH 7.5的溶液稀释50倍）、80 μL 9.0 mmol•L-1 NADPH。

测定OD412下的吸收值。GSSG含量测定如下：200 μL提取液加入1 mL的2-2乙烯嘧啶（稀释50倍）在25°C下水浴1 h再测定OD412下的吸收值。GSH的含量可以从总的GSH和GSSG含量中减去GSSG含量获得。

GSH测定方法：取样品0.5 g，加入预冷的5%磺基水杨酸2.5 ml和少许石英砂，充分冰预研磨，转入离心管中，于4℃下20,000×g离心20min，将上清液分装，液氮冷冻后于-20℃ 保存或直接进行抗氧化剂分析。

取50 μL上清液，用5% 磺基水杨酸定容至100 μL （即加入5% 磺基水杨酸50 μL），加入24 μL 1.84 mol•L-1三乙醇胺triethlene diamine以中和样液，加入50 μL 10% 乙烯吡啶Polyvinyl pyridine （用70% 乙醇配制），25℃水浴1 h，以除去GSH，到时加入706 mL 50 mmol•L-1磷酸缓冲液，pH 7.5，内含2.5 mmol•L-1 EDTA，加入20 μL 10 mmol•L-1 NADPH 和80 μL 12.5 mmol•L-1 DTNB（二硫硝基苯甲酸），混匀，25℃保温10 min，到时加入20μL 50 U•mL-1 GR，总体积为1 mL，立即混匀，读出3 min时的OD值。此法用来测定GSSG，总的谷胱甘肽（GSH +GSSG）的测定，只要把上述的乙烯吡啶用等体积的蒸馏水替代即可。以5% 磺基水杨酸为溶剂，用同样的方法制作GSSG标准曲线。

叶绿素含量的测定参照Arnon（1949）的方法。从选取第二片完全展开叶，剪碎，称取0.1 g置于研钵中，加少量80%丙酮研磨成匀浆，定容至25 mL，摇匀并置于避光处，待残渣发白后过滤，以80%丙酮作为对照，在663 nm 和645 nm下读取OD值。样品中叶绿素含量（mg•g-1FW）的计算公式为：叶绿素a含量=0.25（12.7OD663-2.69OD645）；叶绿素b含量=0.25（22.9OD645－4.68OD663）。