RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法(3)

第一节 植物病毒RNA 提取

大多植物病毒RNA 为单链RNA ，并且其极性与mRNA 极性相同，植物病毒RNA 提取较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。

一、材料

提纯TMV病毒液（10mg/ml）。

二、设备

冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。

三、试剂

TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液，无RNA 酶的双菌水。

四、操作步骤

1、取一eppendorf管加入提纯TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12000g离心10分钟。

2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。

3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g离心10分钟。

4、取水相，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。

5、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。

6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟，并溶于无RNA 酶的双菌水或TE缓冲液中。

7、取10ml进行电泳分析，另10ml用于cDNA合成。

[注意]

1、整个操作应尽可能在低温下进行。

2、由于病毒RNA 镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。

cDNA合成技术

Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶,使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括：

20μg 特异性引物

200μl M-MLV第一链缓冲液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃时); 375mmol/l KCl; 　15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物(各2.5mmol/L)

2×625μ rRNasinR RNA 酶抑制剂

10,000μ M-MLV反转录酶, RNase H-

5μg 对照RNA

400μl M-MLV第二链缓冲液(10×)，配方如下：

400mmol/L Tris·Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;

30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。

500μ RNase H

500μ DNA聚合酶Ⅰ

100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ

2×1.25ml 不含核酸酶的水

以上所有试剂除对照RNA 需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA 。

（一） 第一链合成

1. 试剂

[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM和200mM)，TE-饱和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液。

2. 操作步骤

(1) 取一灭菌的无RNA 酶的eppendorf管,加入RNA 模板和适当引物,每μg RNA 使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接头,使用0.3μg),用H2 O调整体积至15μl, 70℃处理5分钟,冷却至室温,离心使溶液集中在管底,再依次加入

5×第一链缓冲液 5μl

rRNasin RNA 酶抑制剂 25U

M-MLV(H- )反转录酶 200U

H₂O 调至总体积25μl

(2) 用手指轻弹管壁,吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),用以第一链同位素掺入放射性活性测定。

(3) 37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1小时

(4) 取出置于冰上

(5) 掺入测定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA终止反应,并使总体积为100μl。可取90μl进行电泳分析(先用苯酚抽提),另10μl进行同位素掺入放射性活性测定。

第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成

注：以上25μl反应总体积中所用RNA 量为1μg,如合成5μg RNA ,则可按比例扩大反应体积, 倒5μg RNA 使用125μl总体积进行合成。

（二） 第二链合成

1、 取第一链反应液 20μl, 再依次加入

10×第二链缓冲液 20μl

DNA聚合酶Ⅰ 23μ

RNase H 0.8μ

H2O 加至终体积为100μl

2、轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出10μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。

3、14℃温浴2小时(如需合成长于3kb的cDNA, 则需延长至3-4小时)。

4、 掺入测定eppendorf管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl进行同位素掺入放射性测定,余下的可进行电泳分析。

5、 cDNA第二链合成离心管反应液70℃处理10分钟, 低速离心后置冰上。

6、 加入2μ T4 DNA聚合酶, 37℃温浴10分钟。

7、加入10μl 200mmol/L EDTA终止反应。

8、用等体积酚:氯仿抽提cDNA反应液,离心2分钟。

9、水相移至另一eppendorf管,加入0.5倍体积的7.5M醋酸铵(或0.1倍体积的1.5M醋酸钠,pH5.2), 混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置30分钟后离心5分钟。

10、 小心丢去上清液,加入0.5ml冰冷的70%乙醇,离心2分钟。

11、 小心移去上清液,干燥沉淀。

12、 沉淀溶于10-20μl TE缓冲液。

（三）同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析

1. 试剂

1mg/ml鲑鱼精DNA， 三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，碱性琼脂糖胶，碱性胶电泳缓冲液，（ 30mM NaOH，1mM EDTA），2×样品缓冲液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚蓝）。

2. 操作步骤

(1) 各取一2(5)中和二(4)反应液各3μl,点于玻璃纤维滤纸,室温干燥, 这些样品代表总放射性活性。

(2) 同样各取3μl中反应液至含有100μl(1mg/ml)鲑鱼精DNA中,混匀,加入0.5ml 5% TCA, 涡旋混合仪混合后置冰上5-30分钟。

(3) 用玻璃纤维滤纸过滤,用冰冷的5% TCA洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml丙酮或乙醇漂洗, 这些样品代表掺入放射性活性。

(4) 分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度,可用盖革计算器,也可用液闪计数。

3. 第一链产量测定

第一链掺入率(%)= 掺入cpm/总cpm ×100%

掺入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反应体积(μl)×(第一链掺入率)

设330为每mol dNTP的平均分子量

合成cDNA量(ng)=掺入dNTP (nmol)×330ng/nmol

mRNA 向cDNA转变率=合成cDNA量(ng) / 模板RNA 量(ng)×100%

例如总放射性活性强度为254,000cpm, 掺入放射性活性强度为3040cpm, 所用RNA 摸板量为1μg,反应体积为25μl, 则:

掺入率＝3040/254000×100%=1.2

掺入dNTP量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol

合成cDNA量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng

mRNA 向cDNA转变率=198nm/1000ng×100%=19.8%

由于1000ng RNA 中20%(5μl/25μl)用于掺入测定,而反应体积占总体积80%,因而实际第一链cDNA合成量。